Нейтрофилов внеклеточной Ловушки: Как создать и визуализировать их

1. ПМН изоляции от человеческой крови Используйте около 24 мл крови человека с ЭДТА или гепарин (10 ЕД / мл) в качестве антикоагулянта. Добавить 6 мл Histopaque 1119 по 15 мл трубки Сокол и тщательно слоя от 5 до 7 мл цельной крови на вершине. Центрифуга в течение 20 минут при 800 мкг без торможения. Аспирацию и отбросить желтоватый и ясный верхний слой и нижний красновато передачи фазы, содержащей гранулоцитов на свежий труб Falcon. Вымойте клетки, заполняя Сокол труб с PBS и центрифуги в течение 10 минут при 300 х г. В то же время подготовить 100% Перколла решение путем смешивания 18 мл Перколла с 2 мл 10х PBS. С 1x PBS подготовить 4 мл растворов 85%, 80%, 75%, 70% и 65% Перколла. Подготовка 2 Сокол трубки с градиентом Перколла отводками 2 мл каждый процент друг на друга в порядке убывания. После центрифугирования супернатант удалить, объединить окатышей и ресуспендирования осажденных клеток в 4 мл PBS. Тщательно слой 2 мл ресуспендирования на каждое из градиентов. Центрифуга в течение 20 минут при 800 мкг без торможения. После центрифугирования удалить верхний слой, и большинство из 65%-слой с МНПК и собирать белый оставшиеся интерфаз до 85% слоя в новые трубы Falcon. Вымойте клетки, заполняя Сокол труб с PBS и центрифуги в течение 10 минут при 300 х г. Удалить супернатант и ресуспендируйте осажденных клеток (обычно> 95% PMN) в 2 мл PBS. Граф клеток с использованием гемоцитометра. 2. Активация PMNs Подготовка 24-клеточной культуре также пластины, поставив стерильные 13 мм круглый скольжения покровного стекла (# 1,5) в каждую лунку Семенной 2 х 10 5 клеток в 500 мкл RPMI (содержащих 2% сывороточный альбумин человека) на лунку и инкубировать в течение 1 ч в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° C. Тем временем подготовить 600 нм PMA решение в RPMI и добавить к клеткам 100 мкл на лунку. Инкубируйте от 15 минут до 4 часов в CO 2 инкубаторе при температуре 37 ° C. Fix клеток в 4% (на конец концентрации) параформальдегид растворяется в PBS. PMA выступает в качестве положительного контроля и до сих пор самым мощным агентом, чтобы побудить NET образования. Кроме того, другие стимулы или совместное культивирование с патогенами могут быть использованы для NET индукции. Соответствующих статусу NET образование может быть проверена, а время идет конечно, если дополнительные параллельные образцы подготовлены. Если, не проникающий ДНК красителя, как Sytox Зеленый (Invitrogen) добавляется к нефиксированным клеток, внеклеточной ДНК только будут обнаружены. С образованием новых НРТ-то нарушения в присутствии Sytox, для каждого момента времени один параллельный пример должен быть использован. 3. NET обнаружения immunolabeling НРТ очень хрупкие, даже после фиксации и должны управляться с большой осторожностью, в противном случае большинство будет теряться во время подготовки. Осторожно снимите скользит стеклянной крышкой с прикрепленными клетки с 24-и культуру пластину, подняв ее вверх на границе с изогнутой иглой и схватить ее тонкой щипцами. Положите покрытие скольжения вниз головой на каплю PBS. Это можно сделать на листе парафильмом покрытия стоят пробирки. Вымойте так 3 раза в течение 5 мин. Инкубируйте крышка скользит в том же порядке в капле 0,5% Тритон Х-100 в течение 1 мин при комнатной температуре, чтобы permeabilize клеток. Промыть 3 раза в PBS в течение 1 мин. Подготовка влажной камере с парафильмом и мокрой ткани. Положите крышку скользит вверх тормашками на каплю блокирующим буфером (5% осла сыворотки) и инкубировать 30 минут при температуре 37 ° C. Развести первичных антител, например мс анти Хистон и РБ анти эластазы нейтрофилов, в блокирующем буфере. Передача крышка скользит по влажной камере непосредственно от блокирующего буфера на падение первичного антитела и инкубировать в течение 1 часа при температуре 37 ° C. Промыть 3 раза по 5 мин с PBS. Развести вторичными антителами, например, DK анти мс Су2 и ДК анти РБ Cy3, в блокирующем буфере. Передача крышка скользит в влажной камере на каплю вторичными антителами и инкубировать в течение 1 часа при температуре 37 ° C. Промыть 3 раза по 5 мин с PBS. В зависимости от вашего флуоресценции вариантов микроскопии, пятна ДНК в течение 5 мин или с Hoechst 33342 (1 мкг / мл), который понадобится УФ возбуждения или с Draq5 для дальнего красного возбуждения и мыть дважды расстояние. водой. Установить 20 мкл капли Mowiol на предметное стекло и смонтировать покрытие скользит с клетками с ног на голову. Клетки должны быть в пределах от скольжения крышкой и слайдов. Капля Mowiol образуют тонкий слой однородной толщины, когда покровным стеклом расположен на капли. Как правило, нет необходимости нажимать образца. Если вы хотите использовать не-погружения линз, образца готова к проверке.Для микроскопического анализа с погружением линзы, не говоря образца сохнуть в течение приблизительно 1 часа, пока Mowiol укрепил на границе образца. 4. Подготовка сети для сканирующей электронной микроскопии (SEM) Сообщение исправить клеток на стеклянные крышки скользит в 24-луночный планшет с 2,5% глутарового альдегида. Удалить стеклянная крышка скользит, содержащих клетки из 24-и культуру пластину и поставить вверх дном на каплю воды. Вымойте так 3 раза в течение 5 мин. Передача крышка скользит обратно в 24-луночных культуре клеток пластину, содержащую 0,5% OsO4 и инкубировать 30 мин. Удалить стеклянная крышка скользит, содержащих клетки из 24-и культуру пластину и поставить вверх дном на каплю воды. Вымойте так 3 раза в течение 5 мин. Передача крышка скользит обратно в 24-клеточной культуре также пластины, содержащей 1% дубильной кислоты и инкубировать 30 мин. Повторите шаги с 4,2 до 4,4 Дегидрировать через такую ​​схему (5 минут каждая): 30% этанола 50% этанола 70% этанола 80% этанола 90% этанола 100% этаноле 100% этаноле 100% этаноле Передача крышка скользит в критической точке сушилку и сухой образцы. Пальто поверхности образца с 5 нм платина / углерод слой с помощью тонкого слоя испарителя 5. Представитель Результаты: Изоляции метод обычно дает нестимулированных жизнеспособных нейтрофилов с чистотой более 95%. При включенной в различные моменты времени после стимуляции иммунной протокол показана последовательность морфологических изменений при NETosis ячейки уплощение, утрата ядерной дольки, потеря гранул и ядро ​​целостность, что приводит к увеличению перекрытия ядерных (т.е. гистонов) и гранулированной (т.е. эластазы нейтрофилов) окрашивания. Этот протокол может служить отправной точкой для анализа специфических взаимодействий патогенов с нейтрофилов. Это взаимодействие можно разрезать более подробно использованием подготовка протокола для сканирующей электронной микроскопии. NET флуоресценции Пример вынужденного нейтрофилов окрашивают в течение NET компонентов (синий = ДНК, красный = гистонов, зеленый = эластазы нейтрофилов). Изображения показывают, помимо NET локализации, ядерной локализации ДНК и гистонов и гранулированных шаблон для эластазы нейтрофилов. SEM PMA стимуляции Сканирующего электронного микроскопа показывает, не стимулируется и PMA-стимулированных нейтрофилов. После стимуляции нейтрофилов выравниваться и производить NET. SEM Сети и шигеллы Более высокое разрешение изображения SEM бактерий Shigella в ловушке NET.