호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

1. 인간의 혈액에서 PMN 격리 항응고제로 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 또는 헤파린 (10 U / ML) 24 ML 인간의 혈액에 대해 사용합니다. 15 ML 팔콘 튜브 6 ML Histopaque 1119를 추가하고 위에 조심스럽게 레이어 5-7 ML 전체 혈액. 제동없이 800 XG에서 20 분 동안 원심 분리기. 기음과 폐기 노란 맑은 상위 레이어를 신선한 팰컨 튜브에 granulocytes를 포함하는 낮은 붉은 단계를 전송합니다. 300 x G. 10 분 PBS 및 원심 분리기와 팔콘 튜브를 작성하여 세포를 씻어 한편 2 ML 10X PBS 18 ML Percoll를 혼합하여 100 % Percoll 솔루션을 준비합니다. 1X PBS 85 %, 80 %, 75 %, 70 % 및 65 % Percoll 4 ML 솔루션을 준비와 함께. 주문을 감소 서로의 위에 모든 비율이 겹겹이 ML하여 Percoll 기울기 2 팰컨 튜브를 준비합니다. 원심 분리가 뜨는을 제거한 후, PBS 4 ML에 쥐똥과 resuspend sedimented 세포를 결합. 그라디언트의 각 방향 resuspension의 신중 레이어 2 ML. 제동없이 800 XG에서 20 분 동안 원심 분리기. 원심 분리 최고 레이어를 제거하고 65% 계층의 대부분 PBMCs와 85 % 계층까지 새로운 팔콘 튜브에 흰색 나머지 타령을 수집 후. 300 x G. 10 분 PBS와 원심 분리기와 팔콘 튜브를 작성하여 세포를 씻어 PBS의 2ml에 뜨는 및 resuspend sedimented 세포를 (보통> 95 % PMN 아르)를 제거합니다. hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. 2. 활성화 PMNs 각 우물에 살균 13mm 원형 유리 커버 슬립 (# 1.5)를 넣어 24 웰 세포 배양 판을 준비 씨앗이 500μl RPMI에서 X 10 5 세포를 잘 당 (2 % 인간 혈청 알부민을 포함)과 37 CO 2 배양기에서 1 시간을위한 품어 ° C. 한편 RPMI에서 600 NM PMA 솔루션을 준비하고 100μl 잘 따라 세포에 추가할 수 있습니다. 37까지 CO 2 배양기에서 4 H 15 분부터 품어 ° C. 4퍼센트 (최종 농도) PBS에 용해 paraformaldehyde에서 세포를 수정. PMA는 긍정적인 제어 역할을하고 지금까지 NET 형성을 유도하는 가장 강력한 대리인이다. 또한, 병원균과 다른 자극 또는 공동 재배는 NET 유도 사용할 수 있습니다. 시간 코스 진행되는 동안 추가 병렬 샘플 준비하는 경우 NET 형성의 각 상태는 확인하실 수 있습니다. Sytox 그린 (Invitrogen)과 같은 비 permeant DNA의 염료가 아닌 고정 셀을 추가하는 경우에만 세포 DNA가 감지됩니다. 새로운 그물 형성이 어떻게든 때마다 포인트, Sytox의 면전에서 장애인이기 때문에 한 병렬 샘플은 사용할 수 있습니다. 3. immunolabeling에 의해 NET 검출 그물도 고정 후 매우 연약하고, 아주 조심스럽게 조작으로 달리 대부분이 준비 중 길을 잃기 쉬우니있다. 신중하게 굽은 바늘로 가장자리에 그것을 리프팅하여 24 잘 문화 플레이트의 부착 세포와 유리 커버 전표를 제거하고 훌륭한 포셉로 점유. PBS의 드롭에 거꾸로 커버 슬립을 넣어. 이 테스트 튜브 스탠드를 덮고 Parafilm 시트에서 할 수 있습니다. 5 분이 3 번 같은 씻으십시오. 트리톤은 X – 100 RT 1 분 세포를 permeabilize하기 위해 0.5 %의 드롭 같은 방식으로 커버 전표를 품어. 1 분을위한 PBS로 3 번 씻으십시오. Parafilm와 젖은 휴지로 습기 챔버를 준비합니다. 덮개가 차단 버퍼 (5 % 당나귀 혈청)의 드롭 거꾸로 미끄러져 누워 37 30 분 품어 ° C. 버퍼를 차단의 기본 항체, 예를 들어 MS 안티 히스톤 및 RB 안티 호중구 엘라스타제을 희석. 기본 항체의 드롭에 버퍼를 차단에서 직접 습기 챔버에서 전표를 커버 37 1 H에 대한 품어 전송 ° C. PBS로 5 분 3 번 씻으십시오. 이차 항체, 예를 들어 DK 안티 MS Cy2와 버퍼를 차단에 DK 방지 RB Cy3를 희석. 이차 항체의 드롭에 습기 챔버에 전표를 커버 37 1 H에 대한 품어 전송 ° C. PBS로 5 분 3 번 씻으십시오. 얼룩 DNA는 UV 여기거나 멀리 붉은 여기에 대한 Draq5로 필요하고 디스트로 두 번 씻어 것입니다 Hoechst 33342 (1 μg / ML)와 중 5 분 들어, 형광 현미경 옵션에 따라 다릅니다. 물. 유리 슬라이드에 Mowiol의 20μl 방울을 설정하고 거꾸로 전지 커버 전표를 탑재합니다. 세포는 커버 슬립 및 슬라이드 사이에 있어야합니다. Mowiol의 드롭 커버 슬립이 드롭 위치는 균일한 두께의 얇은 레이어를 형성합니다. 일반적으로 샘플을 눌러 필요가 없습니다. 가 아닌 침지 렌즈를 사용하려는 경우, 표본은 조사를 위해 준비가 된 것입니다.침지 렌즈와 현미경의 분석을 위해, Mowiol이 샘플의 가장자리 경화까지 약 1 시간에 대한 표본은 건조하게. 4. 전자 현미경을 검사에 대비하여 그물 (SEM) 2,5 %의 글루 타 알데히드 24 – 잘 판에있는 유리 커버 전표에서 세포를 수정 게시합니다. 24 잘 문화 판의 세포를 포함하는 유리 커버 전표를 제거하고 물 한 방울에 거꾸로 내려놔. 5 분이 3 번 같은 씻으십시오. 30 분 0,5 % OsO4과 부화를 포함한 24 웰 세포 배양 플레이트에 다시 커버 전표를 전송합니다. 24 잘 문화 판의 세포를 포함하는 유리 커버 전표를 제거하고 물 한 방울에 거꾸로 내려놔. 5 분이 3 번 같은 씻으십시오. 30 분 1퍼센트 타닌산과 부화를 포함한 24 웰 세포 배양 플레이트에 다시 커버 전표를 전송합니다. 단계를 반복 4.2-4.4 다음과 같은 처방 (5 분 각각)를 통해 탈수 : 30 % 에탄올 50 % 에탄올 70 % 에탄올 80 % 에탄올 90 % 에탄올 100 % 에탄올 100 % 에탄올 100 % 에탄올 임계점 건조기 건조 표본으로 전표를 커버 전송합니다. 얇은 레이어 증발기를 사용하여 5nm 플라틴 / 탄소 층과 표본의 코트 표면 5. 대표 결과 : 절연 방식은 일반적으로 95%보다 순도와 unstimulated 가능한 neutrophils를 산출. 자극 후 다른 시간 시점에서 고정되면, immunostaining 프로토콜 NETosis의 평평화 세포, 핵 lobules의 손실, 과립의 손실과 핵 (히스톤 IE)와 세분화된 (즉,의 증가 오버랩로 연결 핵 무결성 중 형태학의 변경 순서를 보여줍니다 호중구 엘라스타제) 염색법. 이 프로토콜은 neutrophils과 병원균의 특정 상호 작용을 분석하는 출발점이 될 수 있습니다. 이 상호 작용은 전자 현미경을 스캐닝을위한 준비 프로토콜을 사용하여보다 자세한 해부를하실 수 있습니다. NET 형광 NET 구성 요소 (청색 = DNA, 빨강 = 히스톤, 녹색 = 호중구 엘라스타제)의 스테인드 자극 neutrophils의 샘플. 이미지 NET 현지화, DNA와 histones의 핵 지방화 및 호중구 엘라스타제에 대한 세분화된 패턴 외에도 보여줍니다. SEM PMA의 자극 비 자극 및 PMA 자극 neutrophils을 보여주는 전자 현미경을 검사합니다. 자극 후, neutrophils 밖으로 평평하게하고 그물을 생산합니다. SEM 그물과 시겔라 그물에 갇힌 시겔라 세균의 높은 해상도의 SEM 이미지.