Dissociated 성인 포유류의 뉴런으로 DNA의 Microinjection Intranuclear
Summary
cDNA의 직접 intranuclear 주사 후 mitotic 세포에 대한 효과적인 transfection 기술입니다. 이 방법은 하나 또는 여러 개의 cDNA 구조에서 heterologous 단백질 표현의 높은 수준을 제공하고 단일 셀 assays의 다양한 생리학 관련 환경에서 공부하는 단백질 기능을 수 있습니다.
Abstract
기본의 연결을 세포 문화는 그들이 영원히 세포 라인에 비해보다 생물학적으로 관련 시스템을 나타내는 이후 단백질 기능을 연구하기 위해 귀중한 도구입니다. 그러나, 기본 뉴런의 포스트 mitotic 자연은 electroporation 또는 화학적 – 중재 transfection과 같은 일반적인 절차를 사용하여 효과적인 heterologous 단백질 발현을 방지합니다. 따라서, 다른 기술은 효과적이 아닌 나누어 세포의 단백질을 표현하기 위해 채용해야합니다.
이 문서에서는, 우리는 dissociated 성인 동정 뉴런으로 cDNA 구성의 intranuclear 주사를 수행하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 뉴런의 다른 유형에 적용되어이 기술은, 성공적으로 heterologous 단백질 발현을 유도하실 수 있습니다. microinjection 절차에 필수적인 장비는 세포, N 2 (g) 압력 전달 시스템에 연결된 cDNA 용액 가득한 유리 사출 pipet 및 micromanipulator을 시각화하기 위해 거꾸로 현미경을 포함합니다. micromanipulator은 pipet 팁로부터 cDNA 솔루션을 꺼낼 수 가압 N 2의 간단한 펄스로 microinjection의 pipet의 사출 움직임을 조정합니다.
이 기술은 다른 많은 transfection 방법과 관련된 독성을 가지고 일관된 비율로 표현되는 여러 DNA 구조를 가능하게하지 않습니다. 주입된 세포의 낮은 숫자는 물론 같은 electrophysiological 녹음 및 광학 이미징과 같은 단일 세포 연구에 적합 microinjection 절차를 만들지만, 세포 높은 transfection 효율의 큰 숫자를 요구 생화학 assays 적합하지 않을 수 있습니다. intranuclear microinjections는 장비와 시간 투자를 필요로하지만, 생리학 관련 환경에서 heterologous 단백질 표현의 높은 수준을 달성하는 능력이 기술에게 단백질 기능을 조사하기 위해 매우 유용한 도구를합니다.
Protocol
Discussion
일반적인 문제가 발생하여 제안 :
언급했듯이 이전, 성공적인 핵 주사는 조직 문화 판에 점착 성의 세포를 필요에 따라 달라집니다. 주사의 시작을 연기 세포 분리 절차를 따라 몇 시간이 뉴런은 요리의 하단을 준수 할 수 있습니다. 또한, 0.1 MG / 고분자량 폴리 – L – 라이신 (시그마, 세인트 루이스, MO) 요리의 하단 표면에 뉴런의 에이즈 접착력의 ML과 코팅 요리.
DNA의 높은 농도를 삽입하려고 시도하는 특히 microinjection의 pipets의 차단은, 자주 문제가 될 수 있습니다. 플라스미드 DNA를 분리하고 정화 고품질의 분리 컬럼을 사용하고, (스핀 필터, 혈소판 튜브의 회전) 언급된 추가 정화 단계를 수행하면 이전에 주입하는 입자를 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 주사하는 동안 압력 주입기의 "깨끗한"함수는 (0.2 s에 대한 충분합니다) 사용할 수 있지만 그 문제가 해결되지 않으면, 새로운 사출 pipet을 사용해야합니다. microinjection의 pipets의 대부분이 사출 세션 동안 막힌 될 경우, 더 큰 개방과 microinjection의 pipet 도움말을 생산하는 유리 pipet의 풀러의 설정을 변경 고려하십시오.
핵 주사하는 동안 발생 또 다른 문제는 조직 문화 요리의 바닥 표면의 얼룩이다. 이 변화는 바로 깊이 이후 주사하는 동안 pipet 탐색이 고정되는 핵에 주입 pipet 팁의 타겟팅 정확성에 영향을 미칩니다. 따라서,이 Z 축 제한은 같은 접시 내에 주사하는 과정 중에 조정해야합니다. 조정이 필요한 때 명백한 것입니다 (이 핵 주입에 대한 표시 (핵이나 세포가 완전히 놓친 것입니다에 없음 흰색 깃털) 없다, 또는 사출 pipet 팁 가까이 접시의 바닥에 오는 될 세포 압축 혹은) 접시의 바닥에 pipet 팁을 충돌. 유리 – 복제 실린더가 (. OD 10mm, 캣 번호 2090-01010, Bellco 유리, 바인랜드, 뉴저지)보다 작은 밀폐된 공간에서 그들을 제한하는 뉴런의 도금을하는 동안 사용할 수 있으므로 이동하는 데 필요한 거리를 최소화 주사 사이 사출 pipet. 이러한 복제 실린더는 microinjections를 수행하기 전에 제거됩니다.
기술의 단점 :
Intranuclear microinjections은 기술적으로 인내와 운영자가 수동 손재주의 높은 수준을 요구하는, 요구하고 있습니다. 이 기술 능력, 다른 기술과 마찬가지로, 연습과 함께 제공됩니다. 그러므로, 그것은 실제 실험을 시도하기 전에 혼자 리포터 유전자의 핵 주사 연습 좋습니다. 더 사출 과정을 돕기 위해, 그것은 컴퓨터 프로그램에 micromanipulator과 압력 주입기의 단계를 통합하는 것이 가능해 질 수 있습니다. 이러한 이고르 프로 (WaveMetrics, 레이크 오스 베고, OR)와 같은 프로그램은 (대한 6,7,8 참조 microinjection 설정을 저장하고 반 자동화 사출 과정 다기능 컨트롤러 (ShuttlePro, 컨투어 디자인, 윈더험, NH) 프로그램에 활용할 수 세부 사항).
intranuclear microinjection 기법의 또 다른 단점은 낮은 성공률이다. 시도 핵 주사의 약 10-20% 단백질 표현식로 이어집니다. 이 효율이 표현 세포의 많은 예를 들어, 전기 생리학, 다양한 생화학 assays이 충분하지 않을 수 있습니다 필요하지 않은 애플 리케이션을위한 충분히있을 수 있습니다 반면.
기술의 응용 :
그 결점에도 불구하고, DNA의 intranuclear microinjection은 heterologously 뉴런의 단백질을 표현하는 매우 유용한 기술입니다.
단백질 표현의 높은 수준 때문에 주사, 유전자 전사, 그리고 핵의 plasmids 긴 안정성을 조절 높은 활성 CMV 프로 모터 동안 핵에 출시 plasmids의 다수의 핵 microinjections 함께 얻을 수 있습니다. 표현 이상의 단백질은 단백질 heterologous 높은 수준의이 내생 단백질을 압도하는 데 필요한 지배 – 부정적인 실험에 특히 유용합니다. intranuclear 주사의 또 다른 장점은 여러 구성을 주입 때 핵으로 cDNA 구성의 일관성 비율을 제공하는 능력입니다. 다른 transfection 방법으로, 그것은 reproducibly 같은 접시 이내에 transfections 사이의 서로 다른 세포로 구성 각 DNA의 동일한 비율을 소개하기가 어렵습니다. 핵으로 cDNA 솔루션의 직접 분사는 다양성의 원인을 제거하고 표현 단백질의 비율이 효과적으로 titered 수 있습니다.
전통 transfection 방법 때문에 transfection의 reag과 관련된 핵 9 화학 독성에 DNA의 낮은 정관의 사후 mitotic 세포의 제한된 효과를 가지고엔트 10. 핵 microinjections는 핵에 기계적으로 유전 물질을 도입하여 이러한 문제를 극복합니다. 이 기술이 더 관련되어 있지만, 기능적인 생물 학적 시스템에서 단백질의 효과를 연구하는 능력,이 기술의 힘드는 자연에 대한 보상보다, 내생 신호 경로와 함께 완료되었습니다.
동물의 모든 실험 절차는 애니멀 케어 및 사용을위한 건강의 지침 국립 연구소에 따라 수행되었다.
Acknowledgements
저희 실험실의 연구는 NIH의 교내 연구 프로그램, 알코올 남용과 알코올 중독에 국립 연구소에 의해 지원됩니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ultrafree-MC Filter Unit | Millipore | UFC30VV00 | Durapore PVDF filter; 0.1 μm pore-size | |
| TE buffer | Quality Biological, Inc | 351-010-131 | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0 | |
| Micro-hematocrit capillary tubes | Fisher Scientific | 22-362-574 | Unheparinized Preparation: Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95°C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. |
|
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417 R | With a fixed angle or swinging-bucket rotor | |
| Microloader 20 μl pipet tips | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Microinjection capillary glass | World Precision Instruments | TW120F-4 | Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | With platinum-iridium box filament (part # FB330B) | |
| Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope | Nikon | 20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table | ||
| Charge-coupled device (CCD) camera | Cohu Inc. | 6410 | ||
| Video monitor | Sony Corporation | PVM-122 | Black and White, 9” screen | |
| Micromanipulator system | Eppendorf | 5171 | ||
| Microinjection Unit | Eppendorf | FemtoJet Express | ||
| Microinjection controller | Contour Design | S-PROV2 | Programmable multimedia controller | |
| Igor Pro | WaveMetrics | Version 4.05A | Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda |
References
- Eccles, J. C. The action potential of the superior cervical ganglion. J Physiol. 85, 179-206 (1935).
- Ikeda, S. R. Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein βγ subunits. Nature. 380, 255-258 (1996).
- Schofield, G. G., Ikeda, S. R. Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons. Brain Res. 485, 205-214 (1989).
- Schofield, G. G., Ikeda, S. R. Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons. Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).
- Dean, D. A., Goldman, R. D., Spector, D. L. Chapter 4. Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. 1, 51-66 (2005).
- Ikeda, S. R. Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection. Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).
- Ikeda, S. R. Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection. Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).
- Ikeda, S. R., Jeong, S. W. Use of RGS-insensitive Gα subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons.. Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30, 606-610 (2008).
- Vivaudou, M. Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants. J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).
