Microiniezione intranucleari di DNA in dissociato neuroni dei mammiferi adulti

I. Preparazione per l'iniezione Questa sezione descrive le fasi di preparazione che devono essere prese prima di iniettarlo cDNA nel nucleo dei neuroni. La procedura di isolamento per i neuroni è oltre la portata di questo articolo, ma è importante avere i neuroni dissociate in singole cellule e ben aderente alla superficie inferiore di 35 millimetri dishes cellule cultura (vedi discussione per consigli utili per raggiungere questo obiettivo). Anche se una serie di neuroni diversi potrebbero essere utilizzati, gangli periferici come i gangli cervicale superiore (SCG) o gangli delle radici dorsali sono da preferire per la dissezione perché sono comodamente accessibili e produrre un gran numero di neuroni. Ulteriori vantaggi di usare i neuroni SCG è che sono una popolazione relativamente omogenea di cellule e ben caratterizzati 1,2,3,4. A. Preparazione del plasmide cDNA per l'iniezione Per prevenire la contaminazione o rottura del DNA, i guanti dovrebbero essere indossati durante la preparazione. DNA che codifica per la proteina di interesse è subcloned in un vettore adatto espressione mammiferi, come il PCI (Promega, Madison, WI), ai sensi del regolamento del altamente e costitutivamente attiva da citomegalovirus (CMV) promotore. Se la proteina non è etichettato, un reporter plasmide, EGFP codifica per esempio (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), è co-iniettata per confermare l'iniezione di successo e di espressione. Il DNA è isolato con una alta colonna di separazione di qualità (ad esempio QIAfilter Midi-preparazione kit, Qiagen, Chatsworth, CA) e ulteriormente purificato con una unità di centrifuga filtro con un filtro di PVDF (0,1 micron, Millipore, Bedford, MA) per rimuovere le particelle in preparazione plasmide, che può ostruire pipette iniezione durante il processo di iniezione. I plasmidi sono conservati a -20 ° C ad una concentrazione di circa 1 mg / mL in un buffer adeguato stoccaggio del DNA (es. tampone TE: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). Immediatamente prima di microiniezione, cDNA plasmidico sono diluiti e mescolati alla concentrazione finale desiderata in TE buffer o H 2 O. Tipicamente, 5-10 ng / ml di gene reporter è sufficiente per etichettare le cellule iniettate, e la concentrazione totale di cDNA da iniettare non deve superare i 200 ng / mL dato che il DNA è viscoso ad alte concentrazioni e può ostruire pipette iniezione. Una piccola quantità di cDNA per l'iniezione (microlitri 5-10) si prepara mescolando gocce di soluzione sulla superficie pulita di un piccolo pezzo di Parafilm (lato sotto lo strato di carta). Mescolare le gocce di soluzione insieme da pipeting su e giù più volte con un pipetor ed evitare l'introduzione di bolle d'aria durante la miscelazione. Utilizzando una punta pipetta microloader (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), trasferire la soluzione cDNA ad un tubo di ematocrito appositamente preparato (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Vedere la sezione materiali per le istruzioni sulla preparazione dei tubi di ematocrito (tabella materiali). Posizionare il tubo contenente la soluzione ematocrito cDNA iniezione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Centrifugare la provetta per 15-30 minuti a 10 000 g in una microcentrifuga dotato di un rotore ad angolo fisso o oscillante (Eppendorf), a temperatura ambiente (20-24 ° C) per particelle di sedimento nella soluzione cDNA che possono bloccare le microiniezione pipetta. La soluzione iniettabile cDNA possono essere conservati a temperatura ambiente durante la sessione di iniezione. B. Realizzazione di pipette di iniezione Pipette monouso microiniezione di vetro sono disponibili in commercio (ad esempio Femtotips, Eppendorf), che sono convenienti ma costoso ($ 10 per ogni pipetta microiniezione). Pipette di iniezione può essere prodotto in laboratorio utilizzando un programmabile P-97 estrattore Flaming pipetta Brown (Instrument Company Sutter, Novato, CA) e filamented, a pareti sottili tubi di vetro borosilicato capillare (Strumenti di precisione mondiale, Sarasota, FL). Questa opzione è più conveniente e consente il controllo di forma e dimensione microiniezione pipetta. A due stadi programma viene utilizzato per tirare strette puntali microiniezione. Dal momento che l'apertura di pipette microiniezione è troppo stretto per esaminare al microscopio ottico, la qualità di pipette di iniezione devono essere valutate direttamente iniettando poche cellule prima che le impostazioni del programma sono finalizzati. Di seguito sono approssimativi impostazioni per le impostazioni di calore, tirare, velocità e tempo: (pull 1) 600, 115, 15, 250; (pull 2) 640, 130, 65, 200. Queste impostazioni variano a diversi lotti di vetro e dalla condizione del filamento di riscaldamento l'estrattore, e deve essere adattata alle necessità. Per maggiori dettagli vedi 5. Tirare diversi (2-5) pipette di iniezione per ogni piatto di neuroni da iniettare, in caso di danni o problemi durante la sessione di iniezione. Pipette iniezione di conservare in un recipiente coperto, per evitare che la polvere di entrare la punta della pipetta microiniezione. II. Microiniezione intranucleari tenda "> In questa sezione i dettagli del processo di iniezione del DNA nel nucleo dei neuroni. microiniezione Un set-up base comprende una rovesciata microscopio a contrasto di fase (ad esempio Nikon Diaphot TMD, Nikon, Melville, NY) per visualizzare il processo, micromanipolatore (ad esempio Eppendorf 5171) per controllare il movimento della pipetta di iniezione e una pressione di iniezione (ad esempio Eppendorf FemtoJet Express) per espellere la soluzione di cDNA dalla pipetta. Collegamento della pressione iniettore al micromanipolatore consente la sincronizzazione di questi ultimi due processi durante le iniezioni. Other facoltativo, ma altamente raccomandato, componenti includono un sistema di monitoraggio video montato (CCD, Cohu Inc., San Diego, CA; bianco e nero, monitor video, Sony Corporation, Tokyo, Giappone). Questo sistema non è un requisito assoluto per preparazioni iniettabili; tuttavia, il monitor in bianco e nero offre un elevato contrasto per una migliore visualizzazione del nucleo cellulare e offre una visualizzazione più confortevole durante le sessioni di iniezione lungo. Inoltre, un computer portatile con software per gestire un portatile controller può essere utilizzato per semi- automatizzare il processo di iniezione (vedi la discussione per i dettagli). Il momento ideale per iniettare neuroni SCG è di 3-6 ore dopo la dissociazione. A questo punto, le cellule sono sferiche, strettamente collegato al fondo del piatto, e il nucleo è chiaramente visibile, sotto un microscopio a contrasto di fase, come una centrale rotondo organello con una membrana scura, contenente un singolo o più nucleoli (Figura 1A). Posizionare un piatto di neuroni dissociato al centro del palco microscopio. Regolare la messa a fuoco e ottimizzare l'ottica a contrasto di fase del microscopio così i nuclei dei neuroni sono chiaramente visibili. Pipettare 2 ml di soluzione preparata cDNA in una pipetta microiniezione con una punta di pipetta microloader. Evitare di elaborare una soluzione vicino al fondo della provetta ematocrito dal momento che questo può suscitare le particelle che si stabilì durante la centrifugazione. Il filamento in pipette microiniezione dovrebbero aiutare nel disegno soluzione per la punta, ma se persistono piccole bolle d'aria, picchietti leggermente la parte del vetro per rimuoverli. Inserire la pipetta microiniezione nel supporto capillare della pressione degli iniettori e quindi fissare il supporto al micromanipolatore. Il titolare è fissato ad un angolo di 45 °. Abbassare la pipetta microiniezione nel piatto. Come la pipetta entra nel terreno di coltura, si forma un menisco che influisce sulla rifrazione della luce e riduce la qualità dell'immagine dei neuroni. Per alleviare questo problema, la torretta anello di fase può essere leggermente spostata fino a quando i nuclei dei neuroni sono ancora chiaramente visibili. Alcuni sistemi di pressione di iniezione hanno una funzione "pulito" che si applica la massima pressione d'aria dalla punta microiniezione pipetta per una breve durata. Utilizzare questa funzione per cancellare la pipetta di detriti prima dell'inizio e durante le iniezioni, se la punta sembra intasato. Se il liquido disperso non è visibile sullo schermo durante l'utilizzo di questa funzione, sostituire con una pipetta nuova iniezione. Centro la pipetta microiniezione nel monitor di visualizzazione e allineare la punta accanto a un neurone e nello stesso piano focale come il nucleolo. Impostare questa posizione più bassa l'asse z limite al micromanipolatore. Questa posizione è la profondità della pipetta microiniezione avanzeranno al durante le iniezioni. Ora la posizione della punta di circa 30 micron di sopra di questo punto quindi la pipetta microiniezione cancella la parte superiore dei neuroni. La modalità di "iniettare" di un micromanipolatore 5171 Eppendorf può essere definito con le seguenti impostazioni per eseguire iniezioni intranucleari. Il iniettare funzione è attiva, mentre la funzione di impalare è lasciato. Un percorso di iniezione diagonale (lungo la X e Z-asse) produce la minor quantità di danno cellulare, e quindi la modalità assiale deve essere utilizzato per preparazioni iniettabili. Una velocità d'iniezione di 300 micron / s è sufficiente, e sincronizzare l'accumulo di pressione quando la pipetta microiniezione raggiunge la serie z limite. La pressione iniettore controlla la quantità di soluzione cDNA iniettato nel nucleo. Nella modalità "automatico" di iniezione, la consegna del DNA è a tempo controllato e avviato dal micromanipolatore collegati. La pressione di iniezione (Pi) dovrebbe essere impostata tra 100-200 ettopascal (hPa, 1 hPa ~ 0,015 psi); pressioni d'iniezione superiori non migliorano i tassi di successo o la qualità delle iniezioni e può indicare altri problemi con le dimensioni punta microiniezione pipetta o la purezza del DNA . Una durata di iniezione (ti) di 0,3 s ed una pressione di compensazione (Pc) di 30 hPa, che fornisce una pressione costante positiva a evitare l'entrata di occlusione particelle dal mezzo di coltura in la punta della pipetta, dovrebbe essere usato. Posizionare il neurone per essere iniettato sotto la punta della pipetta microiniezione utilizzando il microscopio assi xy controllo stadio. Allineare la punta della pipetta sopra il centro del nucleo, concentrandosi avanti e indietro tra tlui punta e nucleoli. Iniettare il nucleo premendo il pulsante di iniettare (in micromanipolatore). Per la fase di iniezione, il movimento della pipetta microiniezione e il rilascio della soluzione di cDNA sono controllati dal micromanipolatore. E 'difficile confermare il successo iniezioni intranucleari ad occhio, ma l'iniezione della soluzione di viscosità relativamente bassa cDNA (rispetto per l'ambiente viscoso nucleare), appare spesso come una piuma bianca in contrasto di fase ottica e può essere utilizzato come indicatore di iniezione nel nucleo. A volte la pipetta microiniezione non penetra la membrana nucleare e trilli semplicemente il nucleo. Un tentativo seconda iniezione nella stessa posizione può portare ad una iniezione di successo del DNA nel nucleo. Rigonfiamento della cellula è di solito indicativa di involontaria iniezione citoplasmatica. Inoltre, significativo rigonfiamento nucleare non è ben tollerato dai neuroni e di solito porta alla morte cellulare subito dopo, così, la pressione di iniezione e la durata non deve superare i valori suggeriti. Continua iniettando neuroni, riposizionando la fase microscopio per allineare il neurone successivo sotto la pipetta microiniezione. Sistematicamente navigare attraverso il piatto di iniettare circa 50-100 nuclei prima di tornare il piatto dei neuroni per l'incubatore per l'incubazione durante la notte. Neuroni con successo iniettato può essere identificato il giorno successivo dalla espressione del gene reporter. III. Rappresentante Risultati Figura 1: ganglio cervicale superiore (SCG) neuroni. Contrasto di fase della SCG neuroni 3 ore successive alla dissociazione (A). In questa fase, il nucleo è chiaramente visibile che favorisce l'allineamento della punta della pipetta microiniezione. Il nucleo appare al centro di neuroni con un singolo (a sinistra) o multipla (a destra) nucleoli scuro. SCG neuroni 16 ore dopo l'iniezione di EGFP cDNA nel nucleo (B). Sinistra, SCG neuroni visto sotto a contrasto di fase illuminazione. A destra, immagine epifluorescente dei neuroni stessi che mostra l'iniezione di successo e conseguente espressione di EGFP in un neurone. Barra di scala bianca è di 20 micron. Figura 2: Whole-cell registrazioni delle correnti attraverso heterologously-espresso proteine ​​G accoppiate interiormente rettificazione K + (GIRK) canali da SCG neuroni. GIRK correnti (I GIRK) sono stati evocati da una rampa di tensione di 200 ms da -140 a +40 mV da un potenziale di detenzione di -60 mV (inserto di A) dopo l'attivazione del endogena α 2-adrenergici di noradrenalina (NE, 10 mM) . Tracce sovrapposte sono registrazioni dal neurone stesso e indicare prima (nero) e dopo l'applicazione di uno solo NE (blu) o NE più 10 mM Ba 2 + (rosso). Le linee tratteggiate indicano il livello zero di corrente. Per la registrazione io GIRK, la soluzione esterna contenuta (in mm) 130 NaCl, 5.4 KCl, 10 HEPES, 10 CaCl 2, 0,8 MgCl 2, 15 di glucosio, 15 saccarosio, e 0,0003 TTX, portato a pH 7.4 con NaOH. La soluzione di registrazione interna contenuta (in mm) 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 4 MgATP, e 0,3 Na 2 GTP, portato a pH 7.2 con KOH. La mancanza di corrente suscitato dalla rampa di tensione in presenza di NE in uninjected neuroni SCG (A) dimostra che i neuroni SCG non esprimono canali GIRK endogena. Iniezione di successo di plasmide codifica cDNA un funzionale GIRK canale 11 dà luogo a grandi correnti durante la rampa di tensione quando esposto a NE (B, a sinistra). Le correnti hanno le caratteristiche tipiche delle correnti attraverso i canali GIRK: l'attivazione di una proteina G agonista del recettore accoppiato (NE), la rettificazione verso l'interno, e il blocco delle correnti dai bloccante putativo canale GIRK, Ba 2 + (B, traccia a destra rosso). Cerchi aperti e pieni rappresentano io GIRK presso l'azienda e la corrente di picco, rispettivamente. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 2.