تنقية سكان خلية معينة من قبل الإسفار الفرز الخلية المنشط (FACS)
Summary
لكثير من الدراسات العلمية التي تتطلب تحليلا والبيولوجية والكيميائية للسكان الخلية يجب أن تكون الخلايا في حالة عالية من النقاء. مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) هو الأسلوب الذي متفوقة في الحصول على خلايا نقي السكان.
Abstract
الدراسات التجريبية والسريرية غالبا ما تتطلب عالي النقاء السكان الخلية. FACS هو الاسلوب المفضل لتنقية السكان من النمط الظاهري الخلية المعروفة. معظم طرق أخرى للتنقية وتشمل بالغسل استنفاد تكمل ، وفصل حبة المغناطيسي. ومع ذلك ، FACS ديها العديد من المزايا أكثر من الأساليب الأخرى المتاحة. FACS هو الأسلوب المفضل عند الحاجة نقاء عالية جدا من السكان المطلوب ، عندما كان سكان الخلية المستهدفة يعبر عن مستوى منخفض جدا من علامة تحديد الخلية أو عند السكان تتطلب الفصل على أساس الكثافة علامة التفاضلية. بالإضافة إلى ذلك ، FACS هي التقنية الوحيدة المتاحة لتنقية عزل الخلايا استنادا إلى تلطيخ الداخلية أو بين الخلايا بروتين تعبير ، مثل علامة بروتين فلوري المعدلة وراثيا. FACS يسمح للتنقية من الخلايا الفردية القائمة على التفاصيل والحجم ومضان. من أجل تنقية الخلايا من الفائدة ، والملون لأول مرة مع fluorescently الموسومة الاجسام المضادة (ماب) ، التي تعترف علامات محددة على سطح الخلية المطلوبة للسكان (1). اختيار السلبية للخلايا غير ملوثين غير ممكن أيضا. FACS تنقية يتطلب تدفق عداد الكريات مع فرز القدرات والبرامج المناسبة. لنظام مراقبة الأصول الميدانية ، يتم تمرير الخلايا في التعليق كشرط تيار في قطرات مع بعضها تحتوي على خلية واحدة أمام ليزر. نظام الكشف عن مضان يكشف خلايا الفائدة استنادا المعلمات الفلورسنت محددة سلفا من الخلايا. الصك ينطبق تهمة إلى قطرة تحتوي على خلية من الفائدة ونظام كهرباء انحراف يسهل جمع قطرات المشحونة في أنابيب جمع المناسب (2). نجاح تلطيخ والفرز وبالتالي تعتمد بشكل كبير على اختيار علامات تحديد واختيار خريطة موقع. ويمكن تعديل معايير الفرز اعتمادا على شرط الطهارة والعائد. على الرغم من أن نظام مراقبة الأصول الميدانية يتطلب المعدات المتخصصة وتدريب الموظفين ، وهذا هو الأسلوب المفضل لعزل عالي النقاء السكان الخلية.
Protocol
Discussion
FACS هي تقنية متطورة للغاية لتنقية السكان خلية من الفائدة ، والتي يمكن من خلالها الحصول على درجة نقاوة عالية جدا (95-100 ٪) من السكان التي تم فرزها. لذلك ، هذه التقنية أهمية خاصة بالنسبة للتجارب ، حيث نقاء عالية شرط أساسي (على سبيل المثال ميكروأري التحليل). FACS هو مفيد خاصة خلال الأساليب الأخرى المتاحة للتنقية عندما السكان الخلية يحتاج إلى تنقية استنادا إلى السطح وأعرب علامة الأسبوعية أو عند اثنين أو أكثر من السكان بحاجة إلى تنقية التي لديها مستويات مختلفة من التعبير عن علامة السطح نفسه. على سبيل المثال ، منطقة هامشية تنقية الخلايا B (B220 + CD21 CD23 INT مرحبا / منخفض) ومسامي الخلايا B (B220 + CD21 INT / منخفضة مرحبا CD23) على أساس مستويات التعبير عن CD21 CD23 و. تطبيق آخر هو تزايد FACS احد الفرز الخلية مما يتيح للتحليل الخلايا الفردية (3 ، 4). كما FACS تستخدم عادة لفرز الخلايا معربا عن البروتينات الفلورية التي أعرب وراثيا ، مثل البروتينات الخضراء بروتين فلوري الموسومة (5). يمكن إذا تم تنفيذ عملية الفرز تكون عقيمة مثقف الخلايا. ومع ذلك ، يمكن أن يتعرض للخطر بقاء الخلية والمحصول أثناء الفرز. ويمكن تحسين الجدوى باستخدام الخلايا التي تعتمد على درجة الحرارة المثلى لفرز ومعالجة الأنابيب بعد جمع فورا ان تصل القدرة. ويمكن زيادة الاسترداد باستخدام أنابيب جمع البولي بروبلين ، وجمع الخلايا مرتبة في وسائل الإعلام الغنية المصل وأنابيب جمع عكس بشكل متقطع ، والحفاظ على أنابيب جمع في درجة حرارة مثلى والطرد المركزي لخلايا فرز 10 دقيقة ~ (http://cyto.mednet.ucla.edu / Protocol.htm).
مددت تطوير فارزات عالية السرعة المتطرف في إمكانية تطبيق الفرز في ضبط تدفق السريرية. التطبيقات السريرية المحتملة تشمل نظام مراقبة الأصول الميدانية لتنقية الدم من الخلايا الجذعية من الدم البشري لأغراض علاجية ، وتطبيقات في علاج السرطان ، واستبدال بزل ، فرز الحيوانات المنوية البشرية المكتشفة والمرض في وقت مبكر (6 ، 7).
لتلطيخ متعدد الألوان ، واختيار الأضداد هو خطوة حاسمة ، ويتم اختيار fluorochromes على أساس نظام الكشف عن كل وثيقة معينة. هناك عدد من الشركات التي تبيع فارزات الخلية ، ويختلف التكوين الليزر وفقا لاحتياجات المستخدم. وبالتالي لا يمكن للمرء ببساطة استخدام الأجسام المضادة الدقيقة نفسها التي استخدمت في الدراسات التي نشرت دون أن يؤكد التوافق. الأجسام المضادة لاختيار الأمثل ، ينبغي للمرء أن ينظر في مستوى التعبير عن بروتين يتم فحصها. بصفة عامة ، ينبغي استخدام ما هو متاح من ألمع ملون تألقي الأضداد الموسومة صمة عار على السطح علامات وأعرب خافت ، بينما يمكن استخدام fluorochromes قاتمة للتلوين علامات سطح أعرب للغاية (8). بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يتم تحديد الأجسام المضادة في مثل هذه الطريقة التي تتداخل بين الأطياف انبعاثاتها هو الحد الأدنى. لتلطيخ متعدد الألوان ، فإنه من الصعب للغاية في اختيار ملون تألقي التي لا تتداخل الطيفية. في هذه الحالة ، يتم تنفيذ التعويض.
التعويضات اللازمة للقضاء على التداخل رياضيا مضان بين الطيف انبعاثات fluorochromes المختلفة التي يتم قياسها بواسطة أجهزة الكشف عن (8-10). وبعبارة أخرى ، هو مطروح التداخل مضان من ملون تألقي من طيف ملون تألقي انبعاثات أخرى. احتساب التعويض يتطلب مراقبة غير ملوثين والضوابط الإيجابية واحد لكل ملون تألقي تستخدم لتلوين متعدد الألوان (9 ، 10). ويمكن إجراء التعويض باستخدام الخلايا أو الخرز. حبات سهلة وصمة عار ، وإشارة قوية وتوفر طريقة سهلة لإعداد ضوابط الملون واحد التي لديها fluorophores نفس العينات التجريبية. الخرز التعويض هي مفيدة بشكل خاص عندما يتم التعبير عن بروتين سطح الخلية من الفائدة عند مستوى منخفض ، وعندما السكان خلية من الفائدة يحد من السكان الأولي خلية البداية.
مرة واحدة وقد تم اختيار الأضداد ، ينبغي أن يكون الأمثل نشاطهم عن طريق إجراء تحليل المعايرة. وهذا أمر مهم لا سيما إذا كان الجهاز قد FACS يزر قوية للغاية. ويمكن استخدام تركيزات أدنى من الأضداد في تلطيخ نتيجة الفصل الفقيرة من السكان الخلية المطلوبة من مجموع السكان الخلية. استخدام تركيزات عالية جسم يزيد من فرصة لتلطيخ غير محددة مستضد. ولذلك سوف يسمح للمعايرة الأضداد اختيار تركيز الأجسام المضادة التي تعطي أقصى سطوع للسكان والحد الأدنى من تلطيخ إيجابية خلفية (8).
FACS الآن تقنية موحدة لتنقية مجموعات سكانية فرعية من الخلايا. يمكن استخدامه لفصل أي نوع من الخلايا التي يمكن أن تتولد تعليق خلية واحدة والأجسام المضادة المتوفرة لتحديد السكان الخلية المطلوبة. FACS هو الأسلوب المفضل عند حighly مطلوبة السكان الخلية نقية.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتور بيل Cashdollar لدعمه في استخدام التدفق الخلوي الأساسية.
References
- Herzenberg, L. A., De Rosa, S. C. Monoclonal antibodies and the FACS: complementary tools for immunobiology and medicine. Immunol Today. 21, 383-390 (2000).
- Givan, A. L. . Flow cytometry first principles. , 273-273 (2001).
- Hewitt, Z., Forsyth, N. R., Waterfall, M., Wojtacha, D., Thomson, A. J., McWhir, J. Fluorescence-activated single cell sorting of human embryonic stem cells. Cloning Stem Cells. 8, 225-234 (2006).
- Walker, A., Parkhill, J. Single-cell genomics. Nat Rev Microbiol. 6, 176-177 (2008).
- Sorensen, T. U., Gram, G. J., Nielsen, S. D., Hansen, J. E. Safe sorting of GFP-transduced live cells for subsequent culture using a modified FACS vantage. Cytometry. 37, 284-290 (1999).
- Diamond, R. A., DeMaggio, S. . In living color: Protocols in flow cytometry and cell sorting. , 800-800 (2000).
- Karabinus, D. S. Flow cytometric sorting of human sperm: MicroSort clinical trial update. Theriogenology. 71, 74-79 (2009).
- Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4, 648-655 (2004).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7, 681-685 (2006).
- Tung, J. W., Heydari, K., Tirouvanziam, R., Sahaf, B., Parks, D. R., Herzenberg, L. A. Modern flow cytometry: a practical approach. Clin Lab Med. 27, 453-468 (2007).
