Автоматизированная система для одной молекулы флуоресцентной Измерения поверхностного иммобилизованных биомолекул

1 – Сборка микрожидкостных ячейки Микрожидкостных ячейки производится путем слияния с рисунком, толщиной 2 мм, полидиметилсилоксан (PDMS) диск только что очищенный кварц скольжения покрытия. PDMS диск содержит четыре 30 мкл прямоугольных камерах, к которым обращаются входе и выходе гибкие капилляры связано с резервуаром буфера и шприцевой насос, соответственно, для контролируемого потока буфера. Проточной ячейке поддерживается на ее обратной стороне на оконное стекло и помещен на заказ ячейкой содержащей водяным охлаждением термоэлектрический элемент для регулирования температуры. Для того, чтобы узорной PDMS диск, смешать 10 частей силиконового эластомера базу с 1 частью отвердителя, тщательно перемешать и оставить дегазации в течение 1 часа в вакууме. Осторожно вылейте смесь эластомера на микрожидкостных форму клетки. В нашем случае это 1 "кремниевой пластины с четырьмя полосами (1×10 1×10 4 х 3 х 300 мкм) из отрицательного фоторезиста. Оставьте это вылечить на горячей плите при температуре 70 ° С в течение двух часов. Тщательно очистите вылечить PDMS диск из форм использования лезвия бритвы. Предохранитель диска на 1''стекла (содержащий 8 х 2 мм в диаметре предварительно просверленные отверстия на обоих концах канала) плазмой окислительных обе поверхности в течение 30 секунд. Предохранитель стекла на плоской стороной диска PDMS (сторона не содержащие каналов). Вставьте 2-дюймовый длинный гибкий плавленого кварца капиллярную трубку через отверстие каждый стакан окна, пока не достигнет канала. Вставка иглы, а затем следующие с капиллярной могут облегчить этот процесс. Уплотнение стекла отверстия с помощью быстрого отверждения силиконового литья соединения, такие как Kwik-Cast. Промыть каналов с этанолом и водой, и плазменно-активировать камере вместе с только что очищенный, 1-дюймовый круговой кварца скольжению покрытие в течение 30 секунд. Мы предлагаем очистку это покрытие скольжения использованием пираньи *. Предохранитель покровным стеклом в сторону ячейки, содержащей каналы, герметизация камер. Оставьте собрал ячейки вылечить в течение ночи при комнатной температуре. * Piranha является решением H 2 O 2 и H 2 SO 4 в 1:2.5 пропорциях. Для очистки крышка скользит, погрузите их в пираний при 90 ° С в течение 20 мин. 2 – активация поверхности для иммобилизации молекул Для исследования нуклеиновых кислот, Простейшая схема поверхности иммобилизации состоит из первого слоя стекла или кварца скольжения накрыть биотинилированного бычьего сывороточного альбумина (БСА), а затем стрептавидином. Это позволяет биотинилированного образца будет заблокирован с высокой специфичностью в течение нескольких дней при комнатной температуре. Подключите гибкий шланг с капиллярами для легкой инъекции буфера с помощью шприца и иглы. Inject раствор 0,1 мг / мл биотинилированного БСА в буфере (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl, фильтруется с помощью фильтра 0,02 мкм) в канал и инкубировать в течение 30 мин. Поток 300-500 мкл буфера для удаления любых свободных биотинилированного BSA из канала, стараясь не поймать пузырьки воздуха внутри камеры. Inject раствор 0,1 мг / мл в буфере стрептавидином и инкубировать в течение 15 мин. Затем повторите шаг 3. Поток через 3-5 рМ решение биотинилированного образца. Выполните проверку поверхности и проверить освещение флуоресцентными молекулами. При необходимости увеличивают концентрацию образца для получения лучшего покрытия сетей. Инкубируйте в течение 10 минут и повторите шаг 3. Микрожидкостных ячейка монтируется на этапе моторизованных ху позволяет грубые (до 25 мм), движения с помощью оптически закодированные двигатели постоянного тока, и мелкие (1 нм) движение с помощью двух замкнутых пьезоэлектрические приводы (Physik Instrumente модели М-014 или аналогичные). Это можно сделать либо до, либо после активации поверхности образца иммобилизации. 3 – Подготовка буфера изображений (IB) IB состоит из кислорода ферментативной очистки системы и триплетного тушителя, таких как Trolox. С IB сбрасывается через постоянно на ночь, не менее 10 мл должны быть подготовлены заранее. Подготовка 10 мл 0,8% м / о D-глюкозы, по крайней мере 35 мМ Трис-HCl рН 8,0 и 50 мМ NaCl в деионизованной воде. Чем выше концентрация буфера важно по двум причинам: растворение Trolox будет окисляться решение, и ферментативной реакции будет также ниже рН раствора с течением времени. Так как это решение имеет длительный срок хранения может быть сохранен как маточный раствор. Растворите 5 мг Trolox в буфер, подготовленный в шаге 1 на вортексе в течение нескольких минут, а затем встряхивания в течение> 10 мин. Trolox не очень хорошо растворяется в воде при рН> 7, поэтому не спешите этого шага. Фильтры решения с использованием 0,2 мкм и оставить дегазации в вакууме в течение 10 минут. Подготовка "gloxy" ферментативных решение путем смешивания 60 мкл Уотг, 20 мкл 5X буфера, 20 мкл каталазы, 1 мг оксидазы глюкозы и 100 мкл 10 мг / мл BSA. Фильтры решения с использованием 0,22 мкм центрифуги фильтр. Аккуратно перемешайте буфер, начиная с шага 2 с "gloxy" решение с шага 3 избегая образования воздушных пузырей. Поток IB через канал с постоянной скоростью 5 мкл / мин с использованием механических насосов шприца для контроля расхода. Bubble аргона в IB резервуар для предотвращения кислородом воздуха от повторного растворения в буфер. Сканирования поверхности, локализацию молекулы и приобретение одного следы интенсивности молекула находится под контролем программы LabView, которая позволяет автоматизированного сбора данных 1. Программа сканирует 20×20 мкм 2 областях на 0,2 мкм резолюцию, со скоростью 0,1 мкм / мс. Данные сразу же обрабатываются для получения интенсивности-взвешенный расположение всех пикселей выше фона имеет значение. После иммобилизованных молекул будут найдены, они перемещаются по одному в конфокальной объема и интенсивности донора и акцептора флуорофора регистрируются как функция времени, пока обе photobleach флуорофоров. Стадия затем запрограммировать на переход к новой происхождения 100 мкм далеко, и процесс сканирования повторяется. 4 – представитель Результаты Ниже приведены некоторые изображения, показывающие собравшихся микрожидкостных клетке до активации поверхности и после того, установлен на микроскоп готов к молекуле иммобилизации. Если канал успешной активации, сканирует поверхность должна быть похожа на сканирование показано ниже показаны выбросы доноров красителя (зеленый) и акцепторных (красный) после прямого возбуждения донора. Эти молекулы перемещаются по одному в зондировании объем и флуоресценции регистрируется в течение долгого времени, пока обе photobleach красители, как показано на одном следы молекулы. Из следов подобных можно получить FRET эффективность, которая сообщает о мгновенной донорно-акцепторных разделение, которое в свою очередь, используется для изучения структуры и динамики молекул биологического интереса. Рисунок 1: микрожидкостных клетка с четырьмя каналами, каждый из которых вход / выход капилляров. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1. Рисунок 2: Сотовый установлен на микроскоп готов к измерениям. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 2. Рисунок 3: Настройка для SM-FRET измерений. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 3. На рисунках 4 и 5: Красный и зеленый канал сканирования поверхности иммобилизованных FRET молекул, возбужденных с зеленым лазером. Пожалуйста, нажмите, чтобы увидеть большую версию рисунке 4 , или рисунке 5 . 6, 7, 8 и 9: Интенсивность траектории донора (зеленый) и акцепторных (красный) флуорофоров маркированы, чтобы молекулы ДНК 8, 10, 16 и 18 пар оснований друг от друга. Пожалуйста, нажмите, чтобы увидеть большую версию рисунок 6 , рисунок 7 , рисунок 8 , или на рисунке 9 .