Sistema automatizado para medições única molécula de fluorescência de Superfície-imobilizada Biomoléculas

1 – Montagem da célula microfluídica A célula microfluídica é feita por uma fusão padronizada, 2 mm de espessura, polidimetilsiloxano disco (PDMS) para uma cobertura de vidro de quartzo limpo de fresco. O disco contém quatro PDMS 30 mL câmaras retangulares que são acessados ​​por entrada e saída flexíveis capilares conectados a um reservatório de tampão e uma bomba de seringa, respectivamente, para o fluxo controlado de buffer. A célula de fluxo é suportado em sua parte traseira por uma janela de vidro e colocado em um porta-celular feito sob medida contendo um elemento termoelétrico refrigerado a água para regular a temperatura. Para fazer o padrão PDMS disco, misturar 10 partes de base elastômero de silicone com um agente de cura parte, misture bem e deixe por 1 hora de desgaseificação a vácuo. Delicadamente despeje a mistura de elastômero para o molde de células microfluídicos. No nosso caso, este é um um wafer de silício ", com quatro faixas (1×10 1×10 4 x 3 x 300 mm) feita a partir de fotorresiste negativo. Deixe isso para a cura em uma placa quente a 70 ° C por duas horas. Retire cuidadosamente o disco PDMS curado do molde utilizando uma lâmina de barbear. Fundir o disco em uma janela de vidro 1''(contendo 8 x 2 mm de diâmetro pré-furos em ambas as extremidades dos canais) por plasma oxidante ambas as superfícies por 30 segundos. Fusível as janelas de vidro para o lado plano do disco PDMS (o lado que não contenham os canais). Inserir um tubo de 2 polegadas de sílica fundida longo e flexível capilar através do orifício de cada janela de vidro, até atingir o canal. Inserção de uma agulha e depois seguir com o capilar pode facilitar este processo. Os orifícios de vidro da janela usando um composto de fundição de cura rápida de silicone tais como Kwik-Cast. Enxágüe os canais com etanol e água, e plasma-ativar a célula em conjunto com um recém-limpos, lamínula de 1 polegada circular de quartzo por 30 segundos. Sugerimos a limpeza dessa lamínula usando piranha *. Fundir o lamínula para o lado da célula que contém os canais, de vedação das câmaras. Deixe o celular se reuniram para cura de noite à temperatura ambiente. * Piranha é uma solução de H 2 O 2 e H 2 SO 4 em 1:2,5 proporções. Para limpar o lamínulas, mergulha-as na piranha a 90 ° C por 20 min. 2 – Ativação da superfície para imobilização molécula Para estudos de ácido nucléico, o esquema mais simples imobilização de superfície consiste em primeiro revestimento de vidro ou de quartzo com lamínula biotinilado albumina bovina (BSA) e depois com estreptavidina. Isto permite que a amostra biotinilado a ser imobilizada com alta especificidade para os dias em temperatura ambiente. Conectar tubos flexíveis para os capilares para a injecção de buffer fácil usando uma seringa e agulha. Injetar uma solução de 0,1 mg / ml de BSA biotinilado em tampão A (10 mM TRIS-HCl, pH 8,0, 50 mM NaCl, filtrado através de filtros 0,02 mm) para o canal e incubar por pelo menos 30 min. ML de tampão de fluxo 300-500 A para remover qualquer BSA livre biotinilado do canal, tomando cuidado para não prender as bolhas de ar no interior da câmara. Injetar uma solução de 0,1 mg / ml de estreptavidina em tampão A e incubar por 15 min. Em seguida, repita a Etapa 3. Fluxo através de uma solução pM 05/03 da amostra biotinilado. Realizar um exame de superfície para verificar a cobertura de moléculas fluorescentes. Se necessário, aumentar a concentração da amostra para obter uma melhor cobertura. Incubar por 10 min e repita o passo 3. A célula microfluídica é montado em um palco motorizado xy permitindo movimento (até 25 mm) grossa usando codificada opticamente motores DC, e do movimento (1 nm) bem usando dois acionadores de circuito fechado piezo (Physik Instrumente modelo M-014 ou similar). Isto pode ser feito antes ou após a ativação da superfície para a imobilização da amostra. 3 – Preparar o tampão Imaging (IB) O IB consiste de um sistema enzimático de limpeza de oxigênio e um supressor triplet, como Trolox. Uma vez que o IB é lavada através constantemente durante a noite, pelo menos, 10 ml deve ser preparado com antecedência. Prepare 10 ml de 0,8% w / v D-glicose, pelo menos 35 mM TRIS-HCl pH 8,0 e 50 mM NaCl em água deionizada. A maior concentração de tampão é importante por duas razões: Trolox dissolvendo vai acidificar a solução, ea reação enzimática irá também diminuir o pH da solução ao longo do tempo. Uma vez que esta solução tem uma vida útil longa, pode ser armazenado como uma solução de reserva. Dissolver 5 mg de Trolox no buffer preparada na Etapa 1 em vortex por alguns minutos e, em seguida, balançando para> 10 min. Trolox não é muito solúvel em água em pH> 7, por isso não apressar esse passo. Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 mm e deixar de desgaseificação a vácuo por 10 minutos. Prepare a solução "gloxy" enzimática através da mistura de 60 mL water, 20 l de tampão 5X A, 20 l de catalase, uma glicose oxidase mg e 100 l de 10 mg / ml BSA. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 mM centrífuga. Misture delicadamente o buffer da Etapa 2 com a solução "gloxy" do Passo 3 evitando a formação de bolhas de ar. O fluxo IB através do canal a uma taxa constante de 5 mL / min usando uma bomba de seringa mecânicas para controlar a vazão. Bolha de gás argônio para o reservatório IB para evitar que o oxigênio atmosférico de re-dissolvendo-se no buffer. A varredura de superfície, localização molécula e aquisição de traços de intensidade única molécula é controlado por um programa LabView que permite a coleta de dados automatizada 1. O programa verifica 20×20 M 2 áreas em 0,2 mM resolução, com uma taxa de 0,1 mícron / ms. Os dados são processados ​​imediatamente para produzir intensidade ponderadas localizações de todos os pixels acima da contagem de fundo. Uma vez que as moléculas imobilizadas são encontrados, eles são movidos um por um para o volume confocal e as intensidades do doador e receptor fluoróforo são registrados como uma função do tempo até que ambos photobleach fluoróforos. O estágio é então programado para mover para uma nova origem 100 mm de distância, e o processo de digitalização é repetido. 4 – Resultados Representante Abaixo estão algumas imagens que mostram a célula montada microfluídicos antes da ativação da superfície e depois de ser montado no microscópio pronto para imobilização molécula. Se o canal é ativado com sucesso, verifica a superfície deve ser semelhante ao ilustrado abaixo scans mostrando de emissão do doador de corante (verde) e receptor (vermelho) após a excitação do doador direto. Estas moléculas são movidos um por um para o volume de sondagem ea fluorescência é registrado ao longo do tempo até que ambos photobleach corantes, como mostrado nos traços única molécula. A partir de vestígios como estes pode-se obter a eficiência FRET que informa sobre a separação dos doadores aceitador-instantânea, que por sua vez é usado para explorar a estrutura e dinâmica de moléculas de interesse biológico. Figura 1: Célula microfluídica com quatro canais, cada um com entrada / saída capilares. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1. Figura 2: Célula montado no microscópio pronto para medições. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 2. Figura 3: Configuração para sm-FRET medições. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 3. Figuras 4 e 5: canal vermelho e verde de um exame de superfície de imobilizado FRET moléculas animado com laser verde. Clique para ver uma versão maior da figura 4 , ou a figura 5 . Figuras 6, 7, 8 e 9: trajetórias Intensidade do doador (verde) e receptor (vermelho) fluoróforos rotulados a uma molécula de DNA 8, 10, 16 e 18 pares de bases de distância. Clique para ver uma versão maior da figura 6 , figura 7 , figura 8 , ou a figura 9 .