표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

1 – microfluidic 셀을 조립 microfluidic 세포가 융합하여 만든 패턴, 갓 청소 석영 커버 슬립에 두께 2mm, polydimethylsiloxane (PDMS) 디스크. PDMS 디스크는 버퍼의 제어 흐름, 각각 버퍼 저수지와 주사기 펌프에 연결된 입구와 콘센트 유연한 모세 혈관으로 액세스할 4 가지 30 μl 사각형 실이 포함되어 있습니다. 흐름 세포는 유리 창문하여 뒷면에 지원하고 온도를 조절하기 위해 열전 요소를 냉각 물을 포함하는 사용자 정의 만든 셀 홀더에 배치됩니다. 패턴 PDMS 디스크를 만들려면 1 부분 경화 에이전트 10 부품 실리콘 엘라스토머 기지를 섞어 잘 혼합하고 진공에서 1 시간 동안 degassing 둡니다. 부드럽게 microfluidic 전지 금형에 엘라스토머 믹스를 부어. 우리의 경우, 이것은 부정적인 포토 레지스트로 만든 네 스트립 (1×10 1×10 4 X 3 X 300 μm의)와 1 "실리콘 웨이퍼이다. 70 뜨거운 접시에 치료 맡겨 ° C가 두 시간 동안. 조심스럽게 면도날을 사용하여 금형의 치료 PDMS 디스크 껍질. 30 초 동안 양쪽 표면을 산화 플라즈마에 의해 1 '유리 창 (채널의 양쪽에 8 X 2mm 지름 사전 뚫고 구멍을 포함)에 디스크를 융합. PDMS 디스크의 평면쪽으로 유리 창문을 (채널을 포함하지 않는 측면) 퓨즈. 이 채널에 도달할 때까지 각각의 유리 창문의 구멍을 통해 2 인치 긴 유연한 융합 실리카 모세관 튜브를 삽입합니다. 먼저 바늘을 삽입 후 모세관과 함께 다음과 같은 것은이 과정을 촉진 수도 있습니다. 퀵 – 캐스트와 같은 빠른 경화 실리콘 주조 화합물을 사용하여 유리 창 구멍을 밀봉합니다. 에탄올과 물을 채널 린스, 30 초 동안 갓 청소, 1 인치 원형 석영 커버 슬립과 함께 셀 플라즈마 활성화. 우리는 피라 냐는 물고 기지 너한테 줄을 사용하여이 표지 전표 청소 제안 *. 챔버 스를 밀폐, 채널을 포함하는 세포의 측면에 커버 슬립을 후세. 실온에서 하룻밤 치료 조립 세포를 남겨주세요. * 피라 냐가 H 2 O 2, H 1:2.5 비율 2 SO 4의 솔루션입니다. 커버 전표를 청소하려면 90에서 피라 냐는 물고 기지 너한테에 젖어 ° C를 20 분. 2 – 분자 고정을 위해 표면을 활성화 핵산 연구의 경우 단순한 표면 고정 제도는 먼저 코팅의 유리 또는 biotinylated 소 혈청 (BSA) 알부민 후 streptavidin과 함께 석영 커버 슬립을 구성되어 있습니다. 이것은 biotinylated 샘플은 상온에서 일 높은 특이성과 함께 움직일 수 있습니다. 주사기와 바늘을 사용하여 쉽게 버퍼 주사에 대한 모세 혈관 유연한 튜빙을 연결합니다. 0.1 버퍼 biotinylated BSA의 MG / ML의 솔루션을 주사 (10 MM 트리스 – HCL, pH를 8.0, 50 MM NaCl는 0.02 μm의 필터를 사용하여 필터링) 적어도 30 분 채널과 부화에. 버퍼의 흐름 300-500 μl은 챔버 내부에 기포가 트랩되지 않도록주의하고, 채널에서 모든 무료 biotinylated BSA를 제거합니다. 0.1의 솔루션을 주사 버퍼에 MG / streptavidin의 ML 15 분 알을 품다. 그런 다음 3 단계를 반복합니다. biotinylated 샘플의 3-5 PM 솔루션을 통해 흐름. 형광 분자의 범위를 확인하기 위해 표면 검사를 수행합니다. 필요하다면, 더 나은 보험을 얻기 위해 샘플 농도를 높일 수 있습니다. 10 분 부화하고 3 단계를 반복합니다. microfluidic 세포는 광학 인코딩 DC 모터를 사용하여 정밀 (최대 25mm) 운동을 허용하는 전동 XY 스테이지에 탑재하고, 고급 (1 NM) 모션 두 폐루프 압전의 액츄에이터를 사용하는 (Physik Instrumente 모델 M – 014 또는 이와 유사한 것). 이 중 앞이나 샘플 고정을 위해 표면을 활성화하면 할 수 있습니다. 3 – 이미징의 버퍼 (IB)를 준비 IB는 Trolox으로 효소 산소 청소 시스템과 트리 플렛 끄는로 이루어져 있습니다. IB가 지속적으로 하룻밤을 통해 플러시되기 때문에, 적어도 10 ML은 사전에 준비되어야합니다. 0.8 % 10 ML W / V D – 글루코오스, 적어도 35 MM 트리스 – HCL 산도 8.0 탈이온수에 NaCl 50 MM를 준비합니다. 버퍼의 높은 농도는 두 가지 이유 때문에 중요하다 : 해소 Trolox는 솔루션을 시어지다되며, 효소 반응은 시간이 지남에 따라 솔루션의 산도를 낮춰드립니다. 이 솔루션은 긴 수명을 가지고 있기 때문에 그것은 주식 솔루션으로 저장할 수 있습니다. 몇 분 동안 vortexing 후> 10 분 흔들어하여 1 단계에서 준비 버퍼에 Trolox 5 MG를 디졸브. Trolox는 산도> 7 시에 물에 매우 용해되지 않으므로이 단계를 서두 르 지마. 0.2 μm의 필터와 10 분 진공 degassing두고 사용하여 솔루션을 필터링합니다. 60 μl 웨이트를 혼합하여 "gloxy"효소 솔루션을 준비R, 5 배 버퍼 A, 카탈 라 아제 20 μl, 1 MG 포도당 산화 효소와 10 100 μl가 MG / ML BSA 20 μl. 0.22 μm의의 원심 분리기 필터를 사용하여 솔루션을 필터링합니다. 부드럽게 공기 거품의 형성을 피하기 위해 3 단계에서 "gloxy"솔루션과 함께 2 단계에서 버퍼를 섞는다. 흐름 속도를 제어하는​​ 기계 주사기 펌프를 사용하여 5 μl / 분 일정한 속도로 채널을 통해 IB를 흐름. 버퍼로 다시 용해에서 대기 산소를 방지하기 위해 IB 저수지에 거품이 아르곤 가스. 표면 검사, 단일 분자 강도 흔적의 분자 현지화 및 인수는 자동 데이터 수집 1 수 LabView 프로그램에 의해 제어됩니다. 이 프로그램은 0.1 μm의 / MS의 속도, 0.2 μm의 해상도에서 20×20 μm의 두 영역을 검색합니다. 데이터는 즉시 강도 – 가중 배경 카운트 위의 모든 픽셀의 위치를​​ 얻을 수로 처리됩니다. 고정화 분자가 발견되면, 그들은 공촛점 볼륨 및 기증자와 수용체의 형광단의 농도로 하나 하나가 모두 fluorophores의 photobleach 때까지 시간의 함수로 기록 이동됩니다. 단계는 다음 100 μm의 거리에 새로운 기원로 이동 프로그램이며, 스캔 과정은 반복됩니다. 4 – 대표 결과 아래 표면 활성화 이전과 분자 고정 준비 현미경에 장착 후에 조립 microfluidic 세포를 보여주는 몇 가지 이미지가있다. 채널이 성공적으로 활성화되면, 표면 검사 직접 기증 여기 후 기증자 염료 (녹색)와 수용체 (빨간색)의 방출을 보여주는 아래 그려져 스캔과 유사해야합니다. 이러한 분자는 탐색 볼륨으로 하나씩 이동하며 형광이​​ 두 염료의 photobleach 때까지 시간이 지남에 기록됩니다 단일 분자 흔적에 표시됩니다. 다음과 같은 성분부터 차례로 생물 학적 관심의 분자의 구조와 역학을 탐구하는 데 사용되는 순간 기증자 – 수용체의 분리에 알려줍 걱정 효율성을 얻을 수 있습니다. 그림 1 : 네 채널 Microfluidic 세포, 입구 / 출구 모세 혈관 각. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. 그림 2 : 측정 준비 현미경에 장착 휴대폰. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. 그림 3 : SM – 안달 측정을위한 설정. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 3의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. 그림 4와 5 : 고정의 표면 검사의 빨간색과 초록색 채널 녹색 레이저로 흥분 분자를 무서워. 더 큰 버전을 보려면 클릭하세요 그림 4 , 또는 그림 5 . 피규어 6, 7, 8, 9 : 기증자의 강도 궤도 (녹색)와 DNA 분자 8, 10, 16, 간격 18 basepairs에 표시된 수용체 (적색) fluorophores. 의 더 큰 버전을 보시려면 클릭하세요 그림 6 , 그림 7 , 그림 8 , 또는 그림 9 .