Depletion spezifischer Zellpopulationen durch Ergänzung Depletion
Summary
Um effektiv zu studieren die Funktion des Immunsystems Zellpopulationen ihre Reinigung oft erforderlich ist. Ergänzung Erschöpfung ist eine schnelle und kostengünstige Technik zur Isolierung von Immunzellen Populationen mit hoher Reinheit.
Abstract
Die Reinigung des Immunsystems Zellpopulationen ist oft erforderlich, um ihre einzigartigen Funktionen zu studieren. Insbesondere molekulare Ansätze wie real-time PCR und Microarray-Analysen erfordern die Isolierung von Zellpopulationen mit hoher Reinheit. Häufig verwendete Reinigung Strategien beinhalten fluoreszierende activated cell sorting (FACS), Magnetic Bead Separation und ergänzen Erschöpfung. Von den drei Strategien, Angebote ergänzen Erschöpfung die Vorteile der schnell, kostengünstig, schonend für die Zellen und eine hohe Zellausbeute. Das Komplementsystem besteht aus einer großen Anzahl von Plasmaproteinen, die, wenn aktiviert initiieren einer proteolytischen Kaskade die ihren Höhepunkt in der Bildung einer Membran-Angriffs-Komplex, eine Pore auf einer Zelloberfläche führt zum Zelltod bildet zusammen<sup> 1</sup>. Der klassische Weg wird durch IgM-und IgG-Antikörper aktiviert und wurde zunächst als ein Mechanismus zur Abtötung von Bakterien beschrieben. Mit der Erzeugung von monoklonalen Antikörpern (mAb), kann der Komplement-Kaskade verwendet werden, um eine beliebige Zelle der Bevölkerung in eine Antigen-spezifische Weise zu lysieren werden. Depletion von Zellen durch das Komplement-Kaskade wird durch die Zugabe von Komplement Befestigung Antigen-spezifischen Antikörpern und Kaninchen-Komplement an den Start Zellpopulation erreicht. Die Zellen werden für 1 Stunde bei 37 ° C und die lysierten Zellen werden anschließend durch zwei Runden Waschen entfernt. MAb mit einem hohen Wirkungsgrad für Komplementbindungsreaktion in der Regel führen 95-100% des angestrebten Zellpopulation. Je nach der Reinigung Strategie für die gezielte Zellpopulation, kann eine sinnvolle Ergänzung Erschöpfung für die Zell-Reinigung oder zur Anreicherung von Zellpopulationen, die dann durch eine anschließende Verfahren gereinigt werden können verwendet werden.
Protocol
Discussion
Die Reinigung von Zellpopulationen ist ein gemeinsames Verfahren für die Untersuchung ihrer Funktionen erforderlich. Hier beschreiben wir eine schnelle und effektive Methode zum Abbau Zellpopulationen mit Antigen-spezifischen Antikörpern und Komplement Erschöpfung. Die Erschöpfung von Zellpopulation kann erreicht werden, wenn eine Ergänzung aktivierende Antikörper zur Verfügung, um eine Linie spezifischer Marker werden. Hier haben wir die Depletion von T-Zellen unter Verwendung eines mAb spezifisch für Thy1 gezeigt, äußerte ein Protein im Wesentlichen alle T-Zell-Populationen. Wir erschöpft über 95% der αβ T-Zellen und die restlichen Splenozyten wurden von 68% auf 98% erhöht. Dieser Grad an Reinheit der Zellen ist vergleichbar mit anderen Reinigungsverfahren Strategien einschließlich FACS und Magnetic Bead Separation. Ergänzung Erschöpfung ist eine schnelle Technik, die in 1,5 Stunden durchgeführt werden kann, wenn die Start-Zell-Population entsteht. Ein weiterer Vorteil der Ergänzung Erschöpfung ist, dass jedes Labor kann die Technik durchzuführen, weil es nicht erfordern teure Geräte und Reagenzien. Der einzige große Teile der Ausrüstung erforderlich sind, einem Wasserbad und einer Zentrifuge. Kaninchen ergänzen können aus einer Vielzahl von Anbietern zu einem angemessenen Preis erworben werden (siehe Tabelle der Reagenzien) und viele mAb kann von ATTC erworben werden und lokal zur Kostenkontrolle gewachsen. Im Gegensatz dazu erfordert FACS einem Durchflusszytometer mit cell sorting Kapazität, die in den sechs Zahlen und teuer fluoreszenzmarkierten mAb kosten wird. Magnetic Bead Separation ist preisgünstig, sondern erfordert den Kauf eines Magneten und magnetische Kügelchen, die teuer werden kann. Darüber hinaus sind einige Magnetic Bead Separation Strategien erfordern auch den Kauf von Spalten.
Das größte Hindernis für die Verwendung von Komplement für Zell-Depletion ist die Verfügbarkeit von Komplement aktivierende mAb mit der Antigen-Spezifität erforderlich. Obwohl von Mensch, Maus und Ratte-Antikörper alle die Fähigkeit, zu ergänzen fix haben, sind einige Isotypen besser als andere. Obwohl IgM aus allen drei Arten ist sehr effektiv bei der Befestigung ergänzen die IgG-Isotypen variieren. So kann jeder mAb muss zunächst in einer Pilotstudie getestet werden, um ihre Wirksamkeit zu bestimmen. Für Antikörper, die nicht sehr effizient, kann zwei Runden ergänzen Erschöpfung ohne Auswirkungen auf die Rentabilität der übrigen Zellpopulationen durchgeführt werden. Als Kosteneinsparungen sollten die Antikörper für eine optimale Wirksamkeit titriert werden. Hinzu kommt, dass die verwendeten Antikörper nicht nötig, gereinigt werden. Hybridomüberstände und Aszites-Flüssigkeit arbeiten genauso effektiv, was besonders praktisch ist, IgM-Antikörper, die schwer zu reinigen sind. Wie mit den Antikörpern, ist es unerlässlich, dass die Ergänzung in einer Pilotstudie titriert werden. Eine zu hohe Konzentration führt zum Verlust der Lebensfähigkeit von nicht gezielten Zellpopulationen führen. Wichtig ist auch, dass die Inkubationszeit nicht mehr als 60 Minuten.
In unserem Protokoll haben wir Co-Inkubation der Antikörper und das Komplementsystem zusammen. Allerdings können die Zellen mit dem Antikörper für 15-30 Minuten zu kennzeichnen und gewaschen vor der Zugabe von Komplement. Wenn Sie diese Strategie, stellen Sie sicher an den Antikörper Inkubationen auf Eis, um den Verlust der Zell-Antigen auf der Zelloberfläche zu verhindern durchzuführen, wie dies bei einigen Proteinen durch Patching und Capping oder Rezeptor-Internalisierung. Obwohl hocheffiziente, ist der größte Nachteil bei Erschöpfung Ergänzung zu anderen Methoden verglichen, dass es nicht zur positiven Selektion verwendet werden. So ist es schwierig, Subpopulationen von Zellen zu erhalten. Zum Beispiel würde es schwierig sein, Randzone B-Zellen aus follikulären B-Zellen, die am besten durch FACS erfolgen würde zu reinigen. In dieser Situation könnte die Komplementaktivierung verwendet werden, um T-Zellen führen, um die Anzahl der Zellen, die sortiert reduzieren. Diese Strategie würde die Art der Zeit, die würden Geld sparen und wäre weniger hart auf die Zellen.
Da die Aufreinigung von spezifischen Zellpopulationen ist eine häufige Anforderung eine Reihe von Strategien entwickelt worden. Die wichtigsten Vorteile des Komplementsystems Erschöpfung Strategie sind die Erschwinglichkeit, technische Einfachheit und Zeitersparnis.
Acknowledgements
Ich möchte Sreemanti Basu für die Bereitstellung der Daten für die Abbildung 1 zu danken. Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH AI069358 und die BloodCenter Research Foundation unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 3-4 week baby rabbit complement | Pel-Freez Biologicals | 31061-3 | ||
| Water bath | various | various | An incubator set at 37 °C can also be used. |
References
- Janeway, C., Travers, P. The Immune System in Health and Disease. Immunobiology. , (1994).
- Jones, B. Functional activities of antibodies against brain-associated T cell antigens II. Stimulation of T cell-induced B cell proliferation. Eur J Immunol. 12, 30-37 (1982).
