Um In vitro FluoroBlok Assay invasão tumoral

Pós-rotulagem e medição utilizando BD calceína AM corante fluorescente Células são rotulados para quantificação depois de terem invadido através do Matrigel BD Matrix e atravessou a membrana FluoroBlok BD. Como resultado, apenas a medição de ponto de extremidade de invasão das células podem ser obtidas. Cultivar células para ~ confluência de 80%. Preparar e hidratar o sistema de inserção. Remover o pacote de armazenamento de -20 ° C e deixe-o voltar à temperatura ambiente. Abrir a embalagem de alumínio e adicionar 500 mL quente (37 ° C) de mídia para o interior dos poços de inserção. Permitir que a placa para hidratar por 2 horas a 37 ° C, 5% CO 2. Nota: Não é necessário para reidratar o não revestido BD Falcon FluoroBlok 24 com vários poços Sistema Insert que será usado como um controle de migração celular. Após a reidratação, remova cuidadosamente o meio dos poços de inserção sem perturbar a camada de BD Matrigel Matrix na membrana. O sistema está agora pronto para uso. Preparar suspensões de células por trypsinizing monocamadas de células e ressuspender as células no soro livre de DMEM com 5 x 10 4 células / mL. Nota: Se você estiver usando um tipo de célula diferente que você precisa para determinar a densidade de semeadura ideal. Para determinar a densidade de semeadura ideal para o seu tipo de célula em uma superfície porosa crescimento, use uma gama de densidades de semeadura (células / cm 2) que a densidade de semeadura suportes usados ​​em superfícies não porosas (ou seja, frascos, pratos e placas). Por exemplo, se você semente atualmente em 2,5 x 10 5 células / cm 2, as sementes em concentrações de células diferentes entre 5 x 10 4 e 5 x 10 5 células / cm 2 para determinar a densidade de semeadura ideal inicial. Adicionar 500 mL de suspensão de células (2,5 x 10 4 células) para as câmaras apical. Adicionar 750 mL de chemoattractant (5% FBS em DMEM) para cada uma das câmaras basal, usando as portas de amostra para o acesso. Incubar a BioCoat BD Sistema invasão tumoral e os não revestidos BD Falcon FluoroBlok 24 com vários poços Placa Insert para 20-22 horas a 37 ° C, 5% CO 2 atmosfera. Após a incubação, remova cuidadosamente médio das câmaras apical. Isso pode ser feito por flicking o conteúdo em um recipiente de resíduos. Não toque na superfície inferior do sistema de inserção. Transferir o sistema de inserção em uma placa de 24 poços contendo 500 mL segundo / poço de 4 mcg / ml em HBSS calceína AM. Incubar por 1 hora a 37 ° C, 5% CO 2. A solução calceína AM não é removido da câmara baixa antes da leitura de fluorescência, porque é um corante vital nonfluorescent que é convertido em calceína verde fluorescente por esterases citosólicas. Fluorescência das células invadidas é lido em comprimentos de onda de 494/517 nm (Ex / Em) em um leitor de placas de baixo para leitura fluorescente. O ajuste de ganho pode precisar de ser determinada empiricamente, mas um ganho de ponto médio deve ser um ponto suficiente para o arranque. Um ajuste de ganho que é muito alta pode levar a saturação do detector com amostra altamente fluorescentes, o que pode impedir a aquisição de resultados significativos. Uso de autogain (se suportada pelo seu leitor) não é recomendado. Um microscópio invertido de fluorescência pode ser usada para verificar os resultados, é especialmente útil para fazer isso na primeira vez que executar este ensaio. Nota: É de extrema importância que os Sistemas de Inserção são lidos usando o mapa da placa correta. Para obter informações sobre mapas placa de carregamento ver BD Boletim Técnico n º 436 em www.bdbiosciences.com ou BD contato com o Suporte Técnico (labware@bd.com). Orientação placa correta é com o bem A1 no canto superior esquerdo eo logotipo da BD Flacon orientada para a direita como a placa é inserido no leitor. Redução de dados Os dados são expressos como na seguinte equação: De fundo pode ser subtraído antes do cálculo da invasão celular por cento RFU = relativo unidades fluorescentes.