Rastreamento de Dinâmica de enxerto muscular em animais de pequeno In Vivo Fluorescent Imagem

Preparação celular Isolamento das células satélites Sob anestesia, os músculos dos membros de camundongos transgênicos GFP (C57BL / Ka-βactin-EGFP) são removidos. Após o corte em pedaços pequenos, as células satélite são enzimaticamente dissociado pela incubação do tecido picada com solução de 2% dispase colagenase durante 1 hora a 37 ° C. Neutralize a digestão enzimática com meio de cultura contendo Ham F-10 e 20% FBS, dissociar o músculo por trituração repetido com uma pipeta Pasteur. As células são filtrados através de um filtro de células (ø70-100μm) e então semeadas em uma placa não-revestido por 1 hora a 37 ° C. Remova cuidadosamente o sobrenadante e placa-los em um prato de colágeno revestido. Repita este passo uma hora mais tarde, para purificar os mioblastos. (Pré-plate) Troque a mídia ea placa de células no tempo. Os mioblastos final purificado são cultivadas em meio contendo Ham F-10, 20% FBS, 100 U / ml de penicilina, estreptomicina e 100 mg / ml (média de crescimento), a 37 ° C com 5% de CO2 do ar, 95%. Cultura e expandir a mioblastos primários em meio de crescimento com a adição de FGF básico de 10 ng / ml. Para todos os experimentos in vivo, injetamos 5×10 5 células por músculo TA. Ao colher os mioblastos, destacamos as células usando 0,25% de tripsina / EDTA e lavá-los com PBS duas vezes. O número de células são contadas com um hemocitômetro e as células são ressuspendidas em HBSS a uma concentração de 5×10 4 células / ml. As células concentradas em HBSS são colocados no gelo e injetado dentro de uma hora após a coleta. Vivo na imagem Camundongos machos mdx com a idade de 4-6 semanas são comprados a partir de Jackson laboratório e mantida em uma instalação de alojamento dos animais. Após cerca de uma semana de alojamento para o meio ambiente, os ratos estão prontos para serem implantados com a cultura de células. Antes do transplante das células, o mouse é anestesiado por uma injeção intraperitoneal (ip) da mistura de ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Em seguida, o cabelo em torno da área do músculo TA é removida através da aplicação de Nair para a perna e à espera de 30 segundos para limpe-o com água destilada. Enquanto o mouse está ainda sob anestesia, 5×10 5 células em HBSS 10μl estão lentamente injetadas em cada músculo TA em 3 pontos usando uma agulha de calibre 30. Após o passo 4, o mouse pode ser regularmente fotografada pela fluorescência in vivo de imagens. A fluorescência de imagem da estação Nightowl LB981 (Berthold Technologies, Inc.), equipado com uma câmera de alta charge-coupled sensível, é usado para obter imagens das pernas dificultam dos ratos. No dia da in vivo de imagens, nós primeiro verificar o crescimento do cabelo no músculo TA. Se necessário, voltar a aplicar Nair para remover o cabelo como descrito acima, depois de anestesiar o rato com a mistura de Ketamina e Xilazina. Enquanto o mouse está sob anestesia, colocamos o mouse em uma posição de bruços em um pedaço de papel não-fluorescente preto (papel Artagain preto de Strathmore). Para expor totalmente o músculo TA para uma melhor imagem, que tape as patas traseiras para o papel. Nós colocamos o mouse na câmara de imagem e posição da perna a ser trabalhada no centro do campo de visão da câmera. Nós primeiro mudar o filtro de emissão para tirar uma foto em tons de cinza fotográfica tradicional da perna com um tempo de exposição de 5 segundos. Reajuste a posição do mouse e foco da câmera, se necessário. Os parâmetros de imagem, incluindo o tempo de exposição (1.250 ms), altura de amostra (0,9 cm), etc são mantidas constantes no processo experimental. Em seguida, interruptor no filtro de emissão adequada para o comprimento de onda da proteína verde fluorescente. Tomamos imagem de fluorescência com um tempo de exposição de 1.250 ms e um número binning de 1. Depois de imagem, o mouse é removido da câmara de imagem para uma gaiola que esperar a recuperação. Para a análise, traçamos uma região de interesse (ROI) ao longo dos sinais fluorescentes para medir sua intensidade em termos de fótons por segundo. Também medimos o tamanho do ROI em termos de número de pixels como um outro valor de quantificação. Os experimentos de imagem pode ser repetida a cada semana ou mais freqüentemente ao longo de alguns meses, se necessário, para aquisição de dados longitudinal. No final dos experimentos, o mouse é sacrificados eo músculo TA é colhida para análise histológica.