تتبع المسار Engraftment العضلات في الحيوانات الصغيرة من قبل في فيفو نيون التصوير
Summary
نحن تصف<em> في الجسم الحي</em> مضان التصوير بروتوكول لرصد تجديد العضلات التي GFP المسمى myoblasts بعد زرع في عضلات الهيكل العظمي من الفئران على حد سواء صحية والتصنع. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة تجديد العضلات بزرع أنواع أخرى من الخلايا والعضلات في ظروف أخرى كذلك.
Abstract
ضمور العضلات عبارة عن مجموعة من الأمراض التنكسية العضلات تتميز الفقدان التدريجي للخلايا العضلات مقلص. حاليا ، لا يوجد علاج العلاجية المتاحة. لقد ولدت التطورات الأخيرة في بيولوجيا الخلايا الجذعية آمالا جديدة لتطوير علاجات فعالة تستند الخلية لعلاج هذه الأمراض. وقد استخدم زرع أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية المسمى مع البروتينات الفلورية في عضلات النماذج الحيوانية التصنع على نطاق واسع في هذا المجال. وهناك تقنية غير الغازية لديها القدرة على تتبع مصير الخلايا المزروعة يمكن طوليا كذلك قدرتنا على تقييم من قبل خلايا العضلات engraftment زرع أكثر دقة وكفاءة.
في هذه الدراسة ، ونحن تثبت أن في الجسم الحي مضان التصوير هو طريقة حساسة وموثوق بها لتتبع GFP المزروع (البروتين الفلوري الأخضر) المسمى الخلايا في عضلات الهيكل العظمي الماوس. على الرغم من القلق إزاء الخلفية نظرا لاستخدام الضوء الخارجي اللازمة لاستثارة للبروتين فلوري ، وجدنا أنه من خلال استخدام الفأرة إما عارية أو القضاء على الشعر مع الكواشف إزالة الشعر هو القضاء على جزء كبير من هذه المشكلة. باستخدام كاميرا CCD ، ويمكن الكشف عن إشارة الفلورسنت في العضلة الظنبوبية (TA) الأمامي بعد حقن الخلايا 5 × 5 10 إما من الفئران المعدلة وراثيا أو GFP eGFP transduced myoblast الثقافة. للعضلات أكثر سطحية مثل إبهام اليد الباسطة لأصابع (EDL) ، وحقن الخلايا تنتج أقل من إشارة يمكن كشفها. ويمكن قياس شدة الإشارة وكميا في عدد الفوتونات المنبعثة في الثانية الواحدة في المنطقة ذات الاهتمام (ROI). منذ حصلت على الصور تظهر حدود واضحة ترسيم منطقة engrafted ، يمكن قياس حجم العائد على الاستثمار كذلك. إذا كان يتم وضع الساقين باستمرار في كل مرة ، والتغييرات في عدد من الفوتونات في الثانية الواحدة في العضلات وحجم العائد على الاستثمار يعكس التغييرات في عدد من الخلايا engrafted وحجم المنطقة engrafted. لذا فإن التغيرات في العضلات نفسها مع مرور الوقت وقابلة للقياس الكمي ، وفي الجسم الحي وقد استخدمت تقنية التصوير الفلورسنت أساسا لتعقب نمو الخلايا tumorogenic ، دراستنا تبين أنه أداة قوية تمكننا من تعقب مصير الخلايا الجذعية المزروعة.
Protocol
Discussion
أنشأنا منصة التصوير موثوقة ومستقرة لتتبع الخلايا التي تم زرعها مضان المسمى في عضلات الهيكل العظمي المضيف في هذه الدراسة. GFP المسمى myoblasts من GFP الماوس المعدلة وراثيا لتقف على نوع من الخلايا الجذعية البالغة التي من شأنها أن تكون مرشحة لعلاج الخلايا في المستقبل. التلاعب المستمر بما في ذلك عدد الخلايا ، وحقن الخلايا ، والخلفية واضحة وموقف المعلمة آلة التصوير ومهم من أجل الحصول على صورة ذات جودة عالية وخاصة بالنسبة للتحليل الكمي.
مضان التصوير والعديد من التطبيقات في مجال البحوث الطبية الحيوية كما هو غير الغازية ، وسهلة الاستخدام ، ويحتوي على إنتاجية عالية. بالإضافة التصوير مضان يمكن أن يوفر القياس الكمي على أساس تهم الفوتون ، وإن كان يرجع ذلك إلى توهين ، وتشتت والاستيعاب ، ويمكن أن لا تتمكن من اختراق الضوء على مسافة كبيرة في الأنسجة ، والذي هو أحد أوجه القصور في الأسلوب. وقد بذلت جهود جارية لاستخدام مراسل حمراء أو تحت الحمراء القريبة لزيادة عمق الاختراق من الضوء.
ميزة أخرى من التصوير مضان هو أنه للترجمة إلى العيادات في حال الموافقة على مراسل الفلورسنت محددة للاستخدام البشري. بالمقارنة مع MRI ، CT ، والدائرة ، ومضان التصوير ومرونة عالية لأنها لا تتطلب أجهزة مكلفة وكلاء التصوير. مثال واحد هو مضان المستندة المنظار المنظار ومتناهية الصغر ، التي تم استخدامها في العيادات. من خلال الجمع بين التصوير مضان مع طرائق أخرى ، ونحن نتوقع تحقيق القدرة على اكتساب المعلومات على حد سواء التشريحية والوظيفية عن عمليات بيولوجية كامنة.
Acknowledgements
تم عمل وانغ يانغ Z Y بفضل منحة من AR051181 K02 NIAMS / المعاهد الوطنية للصحة ، والمنح من رابطة الضمور العضلي ومعهد هارفارد للخلايا الجذعية لانغ واي. ويدعم عمل تسنغ سؤال وشو X من قبل برنامج المنح التي منحت للمختبر التصوير الضوئي من بريغهام ومستشفى النساء. فإن الكتاب أود أن أشكر ليو ون من قسم التخدير ، BWH ، للمساعدة التقنية في أعمال الخلية.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NightOwl LB981 | Berthold Technologies |
References
- Ballou, B., Ernst, L. A., Waggoner, A. S. Fluorescence imaging of tumors in vivo. Curr Med Chem. 12, 795-805 (2005).
- Green, . fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
- Godavarty, A., Sevick-Muraca, E. M., Eppstein, M. J. Three-dimensional fluorescence lifetime tomography. Med Phys. 32, 992-1000 (2005).
- Graves, E. E., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Fluorescence molecular imaging of small animal tumor models. Curr Mol Med. 4, 419-430 (2004).
- Graves, E. E., Yessayan, D., Turner, G., Weissleder, R., Ntziachristos, V. Validation of in vivo fluorochrome concentrations measured using fluorescence molecular tomography. J Biomed Opt. 10, 44019-44 (2005).
- Gurfinkel, M., Ke, S., Wen, X., Li, C., Sevick-Muraca, E. M. Near-infrared fluorescence optical imaging and tomography. Dis Markers. , 107-121 .
- Lee, J., Sevick-Muraca, E. M. Three-dimensional fluorescence enhanced optical tomography using referenced frequency-domain photon migration measurements at emission and excitation wavelengths. J Opt Soc Am A Opt Image Sci Vis. 19, 759-771 (2002).
- Xu, X., Yang, Z., Liu, Q., Wang, Y. In vivo fluorescence imaging of muscle regeneration by transplanted eGFP-labeled myoblasts. , (1985).
- Hoffman, R. M. In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins. Curr Top Dev Biol. 70, 121-144 (2005).
- Coulton, G. R., Morgan, J. E., Partridge, T. A., Sloper, J. C. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: I. A histological, morphometric and biochemical investigation. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 53-70 (1988).
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35, 1151-116 (2003).
- Mendell, J. R., Kissel, J. T., Amato, A. A., King, W., Signore, L., Prior, T. W., Sahenk, Z., Benson, S., McAndrew, P. E., Rice, R. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne’s muscular dystrophy. N Engl J Med. 333, 832-838 (1995).
- Bogdanovich, S., Perkins, K. J., Krag, T. O., Khurana, T. S. Therapeutics for Duchenne muscular dystrophy: current approaches and future directions. J Mol Med. 82, 102-115 (2004).
- Morgan, J. E., Coulton, G. R., Partridge, T. A. Mdx muscle grafts retain the mdx phenotype in normal hosts. Muscle Nerve. 12, 401-409 (1989).
- Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L., Wagers, A. J. Determinants of skeletal muscle contributions from circulating cells, bone marrow cells, and hematopoietic stem cells. Stem Cells. 22, 1292-1304 (2004).
- Cerletti, M., Jurga, S., Witczak, C. A., Hirshman, M. F., Shadrach, J. L., Goodyear, L. J., Wagers, A. J. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
