I. condicionado Tissue – Dia 0 Após o recebimento do kit EpiDerm EPI-200 SIT, verificar todos os componentes do kit de integridade (para detalhes veja a Tabela kit de reagentes e equipamentos específicos). Para cada três tecidos EpiDerm, prepare uma placa de 6 poços estéreis pré-cheia com 0,9 ml de meio de ensaio. Em condições estéreis, abrir o saco plástico contendo a placa de 24 poços contendo os tecidos EpiDerm e remova a gaze estéril. Use uma pinça estéril, para remover cada inserção que contém o tecido EpiDerm e coloque a pastilha na placa de 24 poços vazios. Durante esta etapa, remover qualquer restantes transporte agarose que adere às paredes externas da inserção pelo gentil blotting em papel de filtro estéril. Dentro dos próximos cinco minutos, inspecionar visualmente os tecidos. Não use tecidos defeituosos ou tecidos que são completamente cobertas com líquido. Utilizando uma zaragatoa de algodão ponta, com cuidado secar a superfície dos tecidos. Tente não tocar o tecido diretamente – efeitos capilares são suficientes para eliminar a umidade da superfície do tecido. Após a secagem da superfície do tecido, a transferência de três tecidos para a linha superior das placas de seis poços pré-cheia com 0,9 ml de meio de ensaio. Libertar quaisquer bolhas de ar aprisionadas debaixo do inserções. Coloque as placas de 6 poços contendo as inserções na incubadora para a 60 ± 5 min de pré-incubação a 37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% UR (Umidade Relativa). No final dos anos 60 período de 5 min ± pré-incubação, transferir as inserções dos poços superior nos poços inferiores da placa de 6 poços. Coloque as placas de volta para a incubadora (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% UR) por um dia para o outro pré-incubação (18 ± 3 h). Coloque o restante do meio de ensaio para a (5 ± 3 ° C). Geladeira Após a noite de pré-incubação, os produtos químicos teste pode ser aplicado para os tecidos EpiDerm. Nota: O procedimento de pré-incubação pode ser encurtado em caso de entrega tardia do tecido (por exemplo, se os tecidos chegam na quarta-feira em vez de terça-feira). II. Exposição a substâncias químicas – Dia 1 Prepare uma placa de 6 poços por produto químico teste preenchendo a linha superior apenas com 0,9 ml por poço de meio de ensaio. Aproximadamente 5 minutos antes da exposição prevista para produtos químicos, remover as placas de 6 poços contendo os tecidos pré-condicionado da incubadora. Avaliar a superfície dos tecidos e retirar a umidade usando cotonetes estéreis. Rotular todos os seis tampas bem-placa com os códigos de testar o material ou nomes. Dose os tecidos com os produtos químicos teste em intervalos de 1 minuto para facilitar a lavagem dos produtos químicos de teste após a exposição. Mantenha as placas com tecidos dosado na capa estéril, até que o tecido última é dosado. Para testar produtos químicos líquidos, dispensar 30 mL da solução diretamente sobre o tecido e colocar a malha de nylon na superfície dos tecidos. Se necessário, suavemente a posição da malha usando o bulbo de vidro dirigido Pasteur pipeta. Não pressione a superfície do tecido. Para semi-sólidos de teste, use uma pipeta de deslocamento positivo para dispensar 30 mL diretamente sobre o tecido. Se necessário, a disseminação química com pipeta Pasteur para cobrir a superfície do tecido, tanto quanto possível. Para materiais sólidos, pouco antes da aplicação da substância de ensaio, umedecer a superfície do tecido com 25 mL de DPBS estéril. Isto irá melhorar o contato da superfície do tecido com a substância química de ensaio. Encha uma colher de 25 mg aplicação calibrada afiada (ou qualquer outra ferramenta apropriada) com aproximadamente 25 mg de material finamente moído teste. Aplicar o teste químico sólido à superfície do tecido. Se necessário, use uma lâmpada de cabeça Pasteur Pipeta para esvaziar completamente a colher. Agite suavemente o inserções para melhorar a difusão do sólido na superfície. No caso de substâncias com consistência cerosa, tentar formar um "cookie como" flat pedaço de cerca de 8 mm de diâmetro e coloque-o em cima do tecido, que foi previamente umedecido com DPBS estéril. Para melhorar o contato entre substância e tecidos, pesar o "cookie" com um aço inoxidável ou de plástico ajuda. Aplicar DPBS como o controle negativo e SDS 5% como controle positivo para os tecidos de controle. Após a administração do tecido passado, transferir todas as placas para 35 ± 1 minuto para a incubadora umidificada (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% UR). Após a 35 ± 1 minuto de incubação a 37 ° C remover todas as placas da incubadora. Coloque as placas na capa estéril e esperar até que um período de 60 minutos de exposição química é preenchido para o primeiro tecido dosado. Depois iniciar o procedimento de lavagem usando a inserir um intervalo de tempo por minuto (para um seguroe que o tempo total de exposição para cada inserção é de 60 minutos). Use um frasco de lavagem para lavar os tecidos com DPBS estéril. Preencha o tecido inserir 15 vezes usando um fluxo constante de DPBS e esvaziá-lo (Nota:. Para os tecidos com uma malha de nylon, lavar a superfície do tecido 5 vezes e remover a malha cuidadosamente com o apontado, pinças afiadas Depois, continue com os restantes 10 lavagens). Após o 15 enxaguar utilizando o frasco de lavagem, submergir completamente a inserção 3 vezes em 150 DPBS ml e agitar para remover o restante do material de teste. Finalmente, lave a inserção do tecido uma vez a partir do interior e uma vez do lado de fora com DPBS estéril. Remova qualquer excesso de DPBS a partir do tecido agitando a inserir e blotting-lo no papel estéril blotting. Transferir as inserções de tecidos riscados para o novo prato 6-bem anteriormente pré-cheia com o meio de ensaio. Todas essas etapas (14-18) deve ser feito dentro de 1 min para cada inserção. Após a última tecido é enxaguado, seco cuidadosamente a superfície de cada tecido com algodão estéril ponta cotonete. Incubar os tecidos na incubadora para o próximo 24 ± 2 horas (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% CO 2, 95% UR). Nota: Cada técnico do ensaio não deve testar mais de 6 substâncias, incluindo os controles positivos e negativos em uma corrida de teste único (set), para poder seguir o protocolo, conforme descrito abaixo III. Meio de troca – Dia 2 Após a 24 ± 2 horas pós-incubação, transferir o insere na parte inferior da placa de 6 poços, pré-cheia com 0,9 ml de mídia. Meios de comunicação de linhas superior pode ser recolhida para análise dos pontos finais adicionais (citocinas, quimiocinas, etc.) Análise dos desfechos secundários é opcional. Continuar com a pós-incubação (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% UR) por mais 18 ± 3 horas. IV. MTT Assay Viabilidade – Dia 3 Etiqueta de duas placas de 24 poços com os nomes químicos ou códigos. Uma placa servirá para a incubação do tecido com MTT e outro para a etapa de extração. Preparar a solução de MTT por descongelamento concentrado MTT (5 mg / ml) e diluir com o diluente MTT. Concentração final da solução de MTT é de 1 mg / ml. Pipetar 300 mL da solução de MTT em cada poço da placa de 24 poços. Retirar as placas de 6 poços de incubadora, blot o fundo das inserções em um mata-borrão, e transferi-los para a placa de 24 poços de pré-preenchido com MTT. Coloque a placa de 24 poços na incubadora (37 ± 1 ° C, 5 ± 1% de CO 2, 95% RH) e incubar por 3 horas ± 5 min. Estritamente as 3 horas o tempo de incubação ± 5 min para evitar o desvio entre as leituras MTT diferentes. Quando a incubação MTT está completa, use uma bomba de sucção para aspirar cuidadosamente o meio MTT de todos os poços. Recarga dos poços com DPBS e aspirar novamente. Repita esta lavagem mais duas vezes e certifique-se que os tecidos estão secos após a aspiração passado. Após a transferência lava as pastilhas a uma placa de 24 poços novos. Mergulhe as pastilhas com cuidado pipetando 2 mL de solução extrator (Isopropanol) em cada inserção. O nível vai subir acima das bordas superiores da inserção, assim, completamente submergindo os tecidos. Selar a placa de 24 poços (por exemplo, com Parafilm ou usando saco de vedação) para inibir a evaporação extrator. Extraia o MTT dos tecidos, pelo menos, duas horas à temperatura ambiente com agitação suave em um shaker placa (~ rpm 120). Extração sem agitação durante a noite também pode ser usado. Após o período de extração é completa, furar as inserções com uma agulha de injeção ou o bulbo de contas pipeta Pasteur e permitir que o extrato a correr para o bem de que a inserção foi tirada. Descartar a inserir perfurado e pipetar a solução no poço de cima para baixo três vezes até que esteja homogêneo. Para cada tecido, de transferência de duas alíquotas 200 mL da solução de formazan púrpura em uma placa de 96 poços de fundo plano de microtitulação. Transferir as duplicatas de acordo com o projeto placa fixa dada na planilha que acompanha este protocolo de vídeo. Para espaços em branco, use isopropanol. Ler a densidade óptica (DO) dos extratos em espectrofotômetro MTT placa de 96 poços usando um comprimento de onda de 570 nm (540-580), sem um filtro de referência. Inserir os resultados na planilha para cálculo automático dos resultados (Figura 1). A substância em estudo é rotulado «irritante» (R38 ou GHS categoria 2) se a viabilidade dos tecidos por cento determinado pelo ensaio de MTT é <50% em relação ao controle negativo. Nota: MTT é tóxico, portanto não se esqueça de usar luvas ao manusear. MTT e proteger a sua tãoluções da luz, já que MTT é sensível à luz. Use solução de MTT dentro de algumas horas após o preparo porque degrada com o tempo. V. Qualidade Assay Controles EpiDerm EPI-200-SIT Critérios de aceitação kit: Modelos in vitro RHE deve fornecer dados consistentes e de alta qualidade ao longo do tempo, não apenas durante o processo de validação (8). Diretrizes recomendadas para garantir a longo prazo reprodutibilidade do ensaio e do desempenho incluem "a caracterização completa de células ou tecidos, amostras de cada lote … para o desempenho, e uso regular de controles e produtos químicos de referência para fornecer uma garantia de consistência de desempenho do ensaio" (9) . Além de critérios de aceitação do ensaio descrito a seguir, cada lote de produção de EpiDerm é o controle de qualidade testada pelo fabricante contra um produto químico de referência adicional (1% Triton X-100). O tempo de exposição necessário para reduzir a viabilidade do tecido a 50% (ET-50) de Triton X-100 é determinado. Para EpiDerm, média anual ET-50 valores têm variado de 5,9 horas para 7,5 horas. O lote a lote para tecidos CV controle negativo (ou seja, a variabilidade da viabilidade de base) foi em média menos de 7,5% por cada ano desde 1996. O valor de ET50 cada lote de produção deve cair dentro de 2 desvios padrão da média histórica Triton X-100 ET50 criada em 1996 (ou seja, ET-50 = 6,7 horas; Limite mínimo de aceitação = 4.8h; limite de aceitação superior = 8.7h), a fim para ser liberado para uso pelo fabricante. EPI-200-SIT Ensaio de aceitação Critério 1: Controle Negativo: O OD absoluta do controlo negativo (NC) tecidos (tratados com DPBS estéril) na MTT-teste é um indicador da viabilidade dos tecidos obtidos no laboratório de testes após o envio e armazenamento de procedimentos e sob condições específicas de utilização. O ensaio atende ao critério de aceitação se o OD significa 570 dos tecidos NC é ≥ 1,0 e ≤ 2,5. EPI-200-SIT Ensaio de aceitação Critério 2: Controle Positivo A solução a 5% SDS (em H 2 O) é usado como controle positivo (PC) e testado em simultâneo com os produtos químicos de teste. Significa simultâneos que o PC tem que ser testada em cada ensaio, mas não mais do que um PC é necessário por testes dia. Viabilidade do controlo positivo deve ser dentro do intervalo de confiança de 95% dos dados históricos. O ensaio satisfaz o critério da aceitação se a viabilidade média de tecidos PC expressos como% dos tecidos controle negativo é de 20%. EPI-200-SIT Ensaio de aceitação Critério 3: Desvio Padrão (SD) A irritação cutânea é previsto a partir da viabilidade média determinada em 3 tecidos único e, portanto, a variabilidade de tecido réplicas deve ser aceitavelmente baixo. O ensaio atende ao critério de aceitação se o SD calculado a partir de viabilidades% cada tecido do 3 identicamente tratados replica é <18%. Resultados representante Figura 1 Resultados obtidos para seis artigos de teste, NC e controle PC -. Parte da planilha para o cálculo automático dos resultados. Produtos químicos teste que reduziu a viabilidade do tecido abaixo de 50% referenciados NC são classificados como irritantes. O teste foi otimizado para fornecer resultados que são suficientemente longe da classificação de corte (50% de viabilidade), aumentando assim a robustez do ensaio. Materiais
