Odak Ca ^{2 + Geçici Algılama}

Bölüm 1: Hazırlık Ca 2 + göstergesi (Oregon Yeşil 488 BAPTA 01:00) Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 AM toz (50 mg) gibi küçük bir miktar 500 ul flakonlarda geliyor. Toz F-127 çözümü, 30 saniye hafifçe sallayarak 40 ul Pluronic ekleyin, daha sonra 460 ul PSS ve 30 saniye hafifçe çalkalanır Nihai çözüm, 10 mcM Oregon Yeşil 488 BAPTA 01:00, 4 x 125 ul alikotları sağlar. -20 C'de saklamak için ışık ve maruz kalmaktan kaçınınız. Bölüm 2: Ca 2 + yükleme Dondurucuda (-20 C) Ca 2 + göstergesi (Oregon Yeşil 488 BAPTA 01:00) çıkarın ve oda sıcaklığında çözünme sağlar. 1 ml bir tüp ve su banyosu yer PSS alın. % 95 O% 2 / 5 saniyede yaklaşık 1 görünen kabarcık bir oranda CO 2 ile Kabarcık. Bubbler kapamak veya Parafilm ile örneğin tüp içine güvenli olması gerekir. Hayvan doku inceleyin ve Sylgard çizgili bir Petri kabındaki, bağ dokusu dikkatli bir şekilde kaldırın. Düz kas organ türü ne olursa olsun, PSS her 10 dakikada yerini olmalı ve doku (PSS üç kez yerine örneğin) ve aşağıdaki diseksiyonu yıkanmalıdır. Vas deferens: doku bir levha üretmek uzunluğu yönlü kesme organ düşünün. Mesane için: kubbenin üst (ön) (arka) mesane boynu boyuna açık. 8 uzun mm ve 1 – baskın kas demetlerinin yönünü kesme detrüsör dorsal yüzeyi boyunca 2 mm genişliğinde, dört şeritler, 6 hazırlayın. Place 'önceden ısıtılmış ve kabarmış' PSS doku disseke. 10 mcM Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 tüp PM 125 ul ekleyin ve biraz sallamak vermek, elle karıştırmak için. Folyo kaplı köpürme ve izin, devam edin. Yeterli doku Ca 2 + göstergesi doku ve düz kas tabakasının kalınlığı boyutu ile değişir almak için zaman alır. Örneğin: 120 dakika (sıçan detrüsör, fare vas deferens) 70 dakika (detrüsör fare, sıçan anococcygeus). Bölüm 3: mikroskopi için 'Ca 2 + yüklü' doku hazırlanması Dikkatli doku bağlantılarını doku spontan hareket (nispeten sağlam doku düz kas hücrelerinin görüntüleme bir özelliği) en aza indirmek ve görüntüleme için uygun bir sitenin konumu (düz bir doku parçası gibi olabilir kolaylaştırmak amacıyla gerekli iki boyut yerine üç) inceledi. En az 5 dakika süreyle doku kabarmış PSS durulayın. Uzanan düz bir levha şeklinde doku (biraz), çizgili Sylgard hazırlık çanak monte edin. Amacı çizebilir uzun 'pimleri' kullanmaktan kaçının; 'pimleri' olarak 25-50 mikron çaplı gümüş tel yerine kısa uzunluklarda ve bir açıyla yerleştirin. (Bu superfusion başlar PSS kaplı geniş bir alana yol) PSS Sylgard astarlı çanak alanından kaçmak değildir ki emin olmak için dikkatli olmak, mikroskop sahne hazırlık tabağına yerleştirin. PSS ile hazırlık superfuse amacıyla pompa açın. Saatte 100 ml 'lik bir oranı genellikle istihdam edilmektedir. Isıtıcı ünitesi açın. Hazırlık çanak (tabanı üzerinde mıknatıs metal şerit her iliştirilmesi) giriş ve çıkış tüpleri ve sıcaklık probu yerleştirin. Çıkış tüpünün ucu yüksekliği, derinliği PSS belirleyecektir. Çıkış aslında (bazen başlangıçta olduğu gibi) PSS kaldırıyor sağlamak için dikkatli olun. Istenilen sıcaklığa, örneğin 33-35 C ulaşmak için ısıtıcı ünitesi sıcaklığı ayarlayın En az 10 dakika süreyle doku gelmesini sağlayınız. Bölüm 4: site Seçim görüntü Uyarma aydınlatma maruz kalma göstergesi photobleach, böylece bir seferde birkaç saniye daha fazla kullanmaktan kaçının. Düşük güç bir hedef (10x ya da 20x) düz kas görüntülemek ve izlemek için uygun bir bölge belirlemek için, mavi bir ışık ile Epifloresans, heyecan verici kullanın. Hareketi (en az olmalı) ve düz kas hücrelerinin sayısı alanında dayalı bir site almak için deneyin. Parlak 'yapılar', görüntü algılama algoritması 'yanlış pozitif', yüksek bir sayı neden olabilir, bu nedenle çok sayıda (örneğin) serpiştirilmiş epitel hücreleri ve fibroblastlar siteleri kaçının. Yüksek bir güç objektif (40x) geçin. Düz kas hücre (ler) yatay yalanlar o kadar (yani hızlı tarama eksenine paralel) veya optik eksen sahne döndürün. Bölüm 5: mikroskopisi Ayrıntıları konfokal mikroskop 'kurmak' nasıl her mikroskop türü için özeldir, amaen önemli hususlar şunlardır: hızı (en Ca 2 + transientler için gerekli minimum 5 Hz); alan çözünürlüğü ve boyutu (her ikisi de ticareti-hız). Bazı aşağıdaki protokol Leica SP2 dik konfokal mikroskop özel. Tipik bir protokol: 5 Hz (256 x 256 piksel, yaklaşık 100 x 100 mm.) Elde edilen 100 çerçeve serisi, 13.5 Hz (256 x 64 piksel, yaklaşık 100 x 25 mm). Tarama kafası iki yönlü hareket (toplama hızı en üst düzeye çıkarmak için) ve 1000 Hz'de satır başına elde etmek için ayarlayın. Bir 'havadar diske' iğne deliği kapatın. Bu değeri, parlaklık ve photobleaching arasında bir trade-off; AOTF 25 ve% 35 arasında Lazer (488 nm) güç ayarlayın. (Ikincisi uzun kayıtları sırasında belirli bir sorun.) 'Tedavi' başına altı siteleri – site başına altı serisi, ve dört edinin. Önemli photobleaching deneyci bu sapmasına neden olsa da, aynı altı siteleri ön-ilaç (örneğin, 'kontrol') ve post-ilaç izlemek amacı yaygındır. 'Zamanı denetimleri yapılmaktadır Ca 2 + görüntüleme gereklidir. Bölüm 6: analiz için hazırlanması Http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html: Resim J indirin ve kurun. Platforma özgü versiyonunu indirin ve sonra, http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar son imageJ.jar dosya indirirken, eski dosya yerine en son sürümüne güncelleme. Apple Mac kullanıcıları: yavaş çalışıyorsa, Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/) java sanal makinesi (JVM) en son sürümünü kullandığınızdan emin olun. Excel_writer.jar indirin: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html ve Eklentiler [dizin]> kavanoza dizin içine yüklemek. JNCT0.08Release.ijm Leica_SP2_Stacker.class: Aşağıdaki dosyaları Eklentiler dizine kopyalayın. Eklentiler kullanarak bu scriptleri her yükleyin [Menü]> Makrolar> Yükle … ImageJ fonksiyonu. Biz yazılım görüntülenebilir içinde tek bir 'film' gibi her serisi üretir Leica SP2 konfokal mikroskop, yazılım (Leica LCS) kullanabilirsiniz, ancak tek tek kare olarak kaydeder. Diziye çerçeveleri yeniden kurmak için: (i) 'kare' tek bir klasörü (örneğin, 'DataFolder> TIFF') olarak yeniden inşa için emin olun. (Ii) Eklentileri [Menü]> Makrolar> Leica_SP2_Stacker seçin. Kök dizini seçin (örneğin, 'DataFolder'). Açılan listesinde (örneğin, 'TIFF /') istediğiniz klasörü seçiniz. Bir çıkış dizini seçin veya yeni bir (örneğin, 'DataFolder> Yığınları') oluşturur. Komut dosyası daha sonra tek tek kareleri serisi yeniden. Bölüm 7: hareket için düzeltme Iyi çivileme ile görüntülü sitenin hareketini en aza indirilmeli ve eşit gergin doku olabilir rağmen, bazı düz kas organları yalnız bağlantılarını dikkatli kaldırıldı olamaz spontan kasılmaları sergilerler. Burada bir dizi içinde kare hizalar ya da eşleşen bir serbestçe kullanılabilir algoritma kullanımı açıklanmaktadır. 'StackReg' (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) ve 'TurboReg' (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). Eklentiler Eklentiler dizine her yükleyin> Makrolar> Kur … (Dosya> Aç …) işlenmek üzere bir yığın yükleyin ve daha sonra ilgi alanına açıkça gösteren bir çerçeve taşımak. Diğer çerçeveler bu referans çerçevesi aynı hizada olacak. Eklentiler> Yığınları> StackReg. Her biri farklı 'Dönüşümler' (yani Çeviri, Katı Cisim, Ölçekli Rotasyon, Afin) en etkili olduğunu belirlemek deneyin. (Daha fazla detay: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) Bölüm 8: Parçacık algılama algoritması Her bir 'site' görüntülü faktörler Ca 2 + transientler algılama etkileyen değişecektir. Her sitenin belirli özellikleri ('parçacık parametreleri' – detaylı aşağıda) ölçerek, algılama sürecini kolaylaştırdı. Ve 'hücre kenar eşiği' Böylece her site için bir hesaplar için eşik çıkarılır ',' oranı için eşik '. Eklentileri [Menü]> Makrolar> Kur … ve 'JNCT0.08Release.ijm' seçeneğini seçin. Eklentileri [Menü]> Makrolar> yük yığını (kısayol: l). Bir dizi seçin ve parçacık parametreleri hesaplamak: a. Için eşik çıkarılır (= arka plan) 'Arka plan' olarak inandığımız üzerinde dikdörtgen bir ROI seçin. Ölçü (kısayol: m). Aşağı Not ORTALAMA. b. Oranının hesaplanması eşik Bir dikdörtgen seçinHücre (ler) optik düz bir alanı çevresinde ROI. Ölçü (kısayol: m). Aşağı ortalama ve standart sapma unutmayın. Bir iki kez daha tekrarlayın VEYA 'kayması' tuşuna basarak bir kerede üç kutu çizebilirsiniz. Hesaplayın ve eşik oranı için bir yere not = ortalama üç değerleri (1 + SD / ortalama) x 32 / siteler çoğaltır. c. Hücre kenar eşiği Image> Yığınları> Z proje … Projeksiyon tipi seçin: 'Ortalama yoğunluğu' Image>> Eşik ayarlayın. Siyah ve beyaz seçin. 'Altında' tanımlayın (üst kaydırıcıyı) limit ve karşılık gelen değeri (kaydırıcıyı sağa) bir yere not edin. Sadece siyah bölgelerde meydana gelen olaylar sayılabilir. 'Reset' düğmesini tıklayın. Yığınları (2 kısayol) analiz Bu aşamada sadece bir seri seçin, yani 'ilk dosya' ve 'son dosya ile aynı olmalıdır. 'Çıkarılır için eşik' ve 'hücre kenar eşiği', 'oranı için eşik değerleri girin. Diğer ayarları varsayılan değerlerine bırakın. Algoritma işlenmiş serisi sol tarafta görülen ve sağda orijinal olduğu bir çift bölmeli pencere üretecektir. Yanlış pozitif ve gözle görünür olaylar, tespit edilmemiş olduğu durumlarda sayısını dikkatli bir şekilde değerlendirmek için bu geçmesi. Ca 2 daha doğru bir algılama almak için + transientler biraz 'parçacık parametreleri' bazı ayarlamak için gerekli olabilir. Sürecin bir 'küçük isabet ve kaçırmak' gibi ilk girişimi olsa da, hangi parametreleri temel olarak bir hızla hissediyorum alır. Algoritması her bir serisi için, bir Excel dosyasını üretir, tespit edilen olayın ayrıntıları özellikleri (genlik, alan ve pozisyon gibi). 'Yanlış' – Bu Excel dosyası, el kaldırılır olabilir algoritma çıkışları (örneğin adım 8.17) bu görüntü dosyalarını inceleyerek tespit.