Фокусное Ca 2 + Переходные Обнаружение в гладкой мускулатуре
Summary
Подробнее методы высокого разрешения Ca<sup> 2 +</sup> Визуализации гладких мышц в изолированных органах, в том числе: подготовка ткани, получения изображений и анализа данных.
Abstract
Са 2 + визуализации гладких мышц обеспечивает понимание клеточных механизмов, которые не могут привести к изменениям мембранного потенциала, таких, как освобождение Са 2 + из внутренних магазинах, а также позволяет несколько ячеек для мониторинга одновременно оценить, например, в связи синцитиальный ткани. Субклеточных Са 2 + переходных распространены в гладкой мускулатуре, но трудно точно измерить из-за проблем, вызванных их возникновения стохастических, более часто широкое поле зрения, в орган, который она склонна к контракту. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали серию изображений протоколов и анализ процедур по приобретению и затем проанализировать, в автоматическом режиме, частоты, амплитуды и местоположение таких событий. Хотя такой подход может быть применен и в других контекстах, наша собственная работа включает в себя обнаружение локальных purinergic Са 2 + переходные для размещения передатчика релиз с резолюцией субмикронных.
АТФ высвобождается в виде cotransmitter от вегетативных нервов, где он связывается с рецепторами на P2X1 гладкой мускулатуры детрузора и семявыносящих протоков. Са 2 + входит гладких мышц, в результате чего purinergic neuroeffector Са 2 + переходные (NCTS). Координационным Са 2 + переходных позволяют оптического мониторинга нейромедиатора выпуска таким образом, что имеет много преимуществ по сравнению с электрофизиологии. Помимо значительно улучшить пространственное разрешение, оптической записи имеет дополнительное преимущество, что позволяет запись передатчик освобождение от многих различимы сайтов одновременно. Кроме того, оптические плоскости фокуса легче поддерживать или исправить в течение длинного ряда записи, чем это репозиционирование внутриклеточных резкое микроэлектрода.
Таким образом, метод для работы с изображениями Са 2 + флуоресценции в котором подробно изложил подготовки ткани, а также приобретение и анализ данных. Мы выделяем использованием нескольких сценариев для анализа таких Са 2 + переходных процессов.
Protocol
Discussion
Выбор флуоресцентных Са 2 + индикатор
Орегон Зеленый 488 BAPTA-1 утра был выбран в качестве Са 2 + индикатор, поскольку он (я) является яркой по сравнению с другими показателями (например, Fluo-4 и кальция зеленый) 1, (II) является чувствительным к физиологическим изменениям в концентрации Са 2 + с К г такого же масштаба 1 к внутриклеточной концентрации Са 2 + [Са 2 +] я (например, семявыносящих протоков 2); (III) загружает много гладких мышечных клеток, что позволяет гладко мышечных клеток связи для мониторинга. Тем не менее, Орегон Зеленый 488 BAPTA-1 АМ без ratioable Са 2 + индикатор, и как таковые не могут быть легко использованы для определения абсолютных [Са 2 +] я. Кроме того, она может также буфера Са 2 + при наличии в высоких концентрациях и насыщается высокими изменения амплитуды [Ca 2 +] я.
Подавление спонтанной сократительной
Спонтанной сократительной способности гладких мышц органов может быть уменьшена фармакологически, таких как, блокируя движение Са 2 + через L-типа Ca 2 +-каналов (например, путем: нифедипин 3; дилтиазем 4). Обратите внимание, что эти препараты значительно уменьшит амплитуду цельноклеточная Са 2 + вспышек / переходных процессов.
Сокращение семявыносящих протоков результатом сочетания в первую очередь purinergic и норадренергической нейротрансмиссии. Фокусное Са 2 + переходных процессов в этой ткани, однако, нечувствительны к норадренергической блокада рецепторов (например, α 1 адренорецепторов, по празозин 5), так что движение может быть уменьшена без изменения координационного Са 2 + переходных процессов.
Кроме того, сокращение может быть предотвращено "вниз" через ингибирование миозина света, например, цепочку киназы вортманнином 6.
Выводы
Мониторинг Са 2 + флуоресценции при субмикронного разрешения мощную технику для изучения после соединительного эффекты нейромедиатора релиз 5,7 и выпуск Са 2 + из внутренних магазинах (например, «искры» 8). Анализ Са 2 + переходных использованием методологии, изложенной здесь является экономически эффективным по сравнению с коммерчески доступных пакетов анализа изображений и позволяет индивидуальные анализа с помощью специально написанный плагин Java для ImageJ.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wellcome Trust оказывает финансовую поддержку (VIP Премия JSY и 074128 исследовательский грант на КЛБ). Совет по медицинским исследованиям Студенчество в RJA
Leica_SP2_Stacker, алгоритм, используемый для импорта Формат TIFF для «реконструкции» в серии, основана на Leica_tiff_sequence, плагин для чтения Leica SP2 Формат TIFF в ImageJ, разработанный Тони Коллинз и используются с его разрешения.
( http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html ) StackReg и TurboReg, алгоритмы, используемые для корректировки движения ткани, основаны на Th venaz и коллеги (1998) 9.
Excel_writer.jar был написан Куртом Де Вос (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html).
JNCT0.08JoVE.ijm, алгоритм регистрации частиц, основан на алгоритме написана KL мозга и описаны ранее 5.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Oregon Green 488 BAPTA-1 AM | Invitrogen | O6807 | 10 x 50 μg | |
| Pluronic F-127 solution | Invitrogen | P3000MP | 20% solution in DMSO | |
| Leica SP2 upright confocal microscope | Leica | |||
| Air table (‘vibration isolated workstation’) | Newport | M-VW-3046-OPT-012140 | ||
| Sylgard 184 elastomer | Dow Corning |
References
- Haugland, R. P., Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).
- Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse. Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).
- Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder. J Physiol. 150, 273-286 (2001).
- Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 564, 201-212 (2005).
- Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens. J. Physiol. 541, 849-862 (2002).
- Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases. J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).
- Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder. J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).
- Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks. Science. 270, 633-637 (1995).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).
