As aminoacil-tRNA sintetases estão presentes tanto em eucariotas como em bactérias. Embora os eucariotas tenham 20 aminoacil-tRNA sintetases diferentes para acoplar a 20 aminoácidos, muitas bactérias não têm genes para todas essas aminoacil-tRNA sintetases. Apesar disso, elas usam na mesma todos os 20 aminoácidos para sintetizar as suas proteínas. Por exemplo, algumas bactérias não têm o gene que codifica a enzima que associa a glutamina ao seu tRNA parceiro. Nesses organismos, uma enzima adiciona ácido glutâmico a todas as moléculas de tRNA de ácido glutâmico, assim como a todas as moléculas de tRNA de glutamina. Em seguida, uma segunda enzima modifica quimicamente o ácido glutâmico para glutamina nas últimas moléculas de tRNA, formando assim o par adequado.
A igual importância do tRNA e da aminoacil-tRNA sintetase foi estabelecida por uma série de experiências em que um aminoácido foi quimicamente convertido em um aminoácido diferente após ser ligado ao seu tRNA emparelhado. Em uma experiência in vitro de síntese proteica, estas moléculas de aminoacil-tRNA "híbridas" inseriram o aminoácido incorreto em todos os pontos da cadeia peptídica onde esse tRNA foi utilizado. Os resultados mostraram que tanto o tRNA como a enzima são igualmente necessários para a adequada tradução da sequência de aminoácidos codificada pelo mRNA.
Nas células, as aminoacil-tRNA sintetases utilizam complementaridade estrutural e química para identificar o tRNA correto que deve ser acoplado ao aminoácido ligado ao seu local ativo. A maioria das tRNA sintetases contém três bolsas adjacentes de ligação nucleotídica, cada uma das quais complementar em forma e carga a um nucleótido no anticodão. Embora estas bolsas reconheçam os nucleótidos específicos no loop anticodão do tRNA, aminoácidos adicionais interagem com o braço que aceita aminoácidos, permitindo assim que o tRNA correto se encaixe no local da síntese da enzima.
