Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

الجزء 1 : إنتاج البيض ، وجمع ليلة قبل الحقن ، التي أنشئت في تربية الأسماك مع فواصل الدبابات في المكان. لزيادة إجمالي إنتاج البيض ، ويمكن تعيين ما يصل السمك في نسبة اثنين إلى واحد من الذكور الإناث إذا رغبت في ذلك. في صباح اليوم التالي ، وبعد تشغيل أضواء الغرفة ، سحب فواصل من عدة دبابات والسماح لحوالي 20 دقيقة من وقت التزاوج دون عائق. باستخدام مصفاة ، وجمع البيض من أقفاص التربية وشطف لهم المياه البيض. صب البيض في صحن بيتري البيض مع الماء وإزالة الأنقاض وبويضة غير مخصبة مع ماصة نقل. ويمكن تجميع الأسماك في خزانات أكبر لانتاج قذائف إضافية من البيض للحقن. ضبط توقيت جمع البيض للسماح للأرقام الحد الأقصى من البيض إلى أن يتم إنتاجها من دون السماح لهم بالمرور المرحلة خلية واحدة. مكان شريحة المجهر في غطاء المقلوب طبق بيتري 100mm. استخدام ماصة نقل إلى خط يصل البيض ضد الجانب من الشريحة التي تشكل عمود واحد. إزالة المياه الزائدة من البيض الشريحة بالضغط على Kimwipe ضد الجانب الآخر البيض. (الشكل 1A) الجزء 2 : سحب إبرة ، التحميل ، وإعداد مع مجتذب micropipette ، سحب الزجاج OD 1.0mm الشعرية إلى قسمين الإبر وتخزينها في طبق بتري 150mm عن طريق وضع المعجون على سلالم سخيفة. يمكن سحب الإبر مقدما. Backload الإبرة مع 3 ميكرولتر من مواد الحقن باستخدام ماصة microloader. يهز بلعة نحو غيض الإبرة حتى هناك فقاعات قليلة أو معدومة المتبقية. بدوره على مصدر الهواء وmicroinjector. ادخال الإبرة في microinjector وضمان ختم ضيقة داخل السكن. تأكد من أن micromanipulator في موقف مناسب للسماح لمجموعة واسعة من الحركة والتكيف. جلب رأس الإبرة في الطائرة من عرض من المجهر ، وارتفاع قبالة المرحلة ، والتركيز على أنحف منطقة الحافة. استخدام زوج من الملقط حادة لقرصة قبالة الإبرة في النقطة التي يترك إبرة ضيقة بما يكفي لاختراق المشيماء وصفار البيض ولكن لا تزال قادرة على إيصال حجم حبة متسقة. ويمكن استخدام قطرة من الزيت المعدني على ميكرومتر لحساب حجم كل حقنة. عندما يحقن في النفط ، مع حبة قطره 0.1 ملم تحتوي على 500 من المواد PL الحقن (1B الشكل) ، وتستخدم عادة حقن كميات من 500 أو PL 1nL. كساد على دواسة القدم ورصد حجم حبة في حين خفضت الإبرة وضبط ضغط الحقن حسب الحاجة. وحقن كميات مثالية ملء ما يقرب من 10 ٪ من حجم البيضة. نوعية رأس إبرة أمر حاسم لتخفيف كل من الحقن والجودة والاتساق في النتائج. الجزء 3 : حقن ضمان أجنة لم تتطور في المرحلة الماضية أربعة الخلية. من الناحية المثالية ، ينبغي أن تكون الأجنة في مرحلة واحدة الخلية. انخفاض الإبرة في اتجاه العمود من البيض ، وعقد الطبق في مكان مع يدك المعاكس. يخترق سطح المشيماء وأدخل صفار بضربة واحدة على نحو سلس في حين يراقب عن أي تكسير أو تمزق في كيس المح. حقن مواد الحقن في صفار (الشكل 1C). تجنب فقاعات الهواء عن طريق الحقن أو تمتد صفار إما أن تكون قاتلة للجنين. تعمل باستمرار على الخط ، وضبط الضغط حسب الحاجة للحفاظ على حجم حبة ومتسقة ، وذلك باستخدام ماصة الحافة ، إزالة البيض التي تبدو غير مخصبة أو دمرت خلال عملية الحقن. بعد الانتهاء من عمود من البيض ، واستخدام تيار من الماء البيض لطيف لنقل البيض حقنها طبق بيتري نظيفة. كرر حسب الضرورة. تبقي عدة أجنة uninjected كمجموعة تحكم. في نهاية يوم واحد ، وإزالة أجنة ميتة وسجل عدد من الأجنة المحقونة. استبدال الماء في طبق البيض دوريا لتقليل فرصة الإصابة. الجزء 4 : نتائج الممثل اعتمادا على ما يجري حقن ، قد الأجنة البقاء بسعر أقل من إخوانهم uninjected. لحسن الحظ ، فإنه من السهل على ضخ كميات هائلة منه ، لذلك هذا نادرا ما يمثل مشكلة. فمن الطبيعي أن تظهر لmorphants التنمية تأخر قليلا. لتوضيح نتائج microinjection ، استخدمنا هذا البروتوكول لمعالجة مستويات البروتين القلب من الزجاج (حج). حج هو بروتين عبر الغشاء اللازمة للتنمية القلب العادي. في غيابها ، مع قلوب الأجنة تطوير مساحات تدفق العملاقة والغرف 1. حقن نحن اثنان morpholinos لم يسبق وصفه ضد حج ، وheg_e3i3_egfr1 heg_e4i4_egfr2 ، عند تركيز 500 ميكرومتر. في آخر أيام 2 الإخصاب ، والضوابط الأخوة uninjected تبدو طبيعية ، كما هو متوقع (2A الرقم وباء). أجنة حقنوا heg_e3i3_egfr1 وذمة الدماغ (الشكل 2C). على الرغم من أن قلوب معظم هذه morphants غيرت التشكل ، والغرف الخاصة بهم الحجم عادة (الشكل 2D). حقن الأجنةبعيوب المعرض heg_e4i4_egfr2 القلب متغير. بعض تبدو طبيعية ، في حين أن البعض الآخر تدفق مساحات كبيرة ومتوسطة الأذينين الموسع (2E الرقم وF). ومتحولة حج ، كما ذكرت سابقا 1 ، لديها الجهاز بشكل كبير وتوسيع تدفق الأذين (الشكل 2G و H). نحن أيضا حقن الأجنة wildtype مرنا مع 400 نانوغرام / ميكرولتر مستنسخة من كامل طول حج [كدنا]. بينما تسيطر uninjected تتطور بشكل طبيعي (الشكل 3A وباء) والأجنة حقنوا حج مرنا المعرض تشكيلة واسعة من الظواهر تتراوح ما بين ظهور wildtype لتصقلب شديد ، وتقصير من محور الجسم الرئيسي ، تنخر في الرأس والجسم ، وعيوب خط الوسط (الشكل 3C ودال). تصطف الشكل 1. الأجنة ليتم حقنه ضد شريحة المجهر في طبق بيتري (A). ويتحدد حجم الحقن عن طريق حقن في الزيوت المعدنية وضعت على ميكرون. وحدة تخزين حقن 500 رر ، التي يشيع استخدامها ، التي يبلغ قطرها 0.1 ملم (B). فورا بعد الحقن ، وmorpholino مرنا أو مرئيا كبقعة تلم في صفار (C). الشكل 2. وفي آخر أيام 2 الإخصاب والأجنة uninjected ليس لديهم عيوب جسيمة (A) أو النمط الظاهري القلب (B). أجنة حقنوا heg_e3i3_egfr1 morpholino وذمة الدماغ (C ، السهم) ولكن عادة حجرات القلب الحجم (D). بعض الأجنة حقنوا heg_e4i4_egfr2 morpholino ومساحات تدفق الموسع والأذينين (E ، F). حج والمسوخ مساحات تدفق الموسع بشدة والأذينين (G ، H). (أ) و (C) ، (E) ، و (G) هي صور مدينة دبي للإنترنت 4X ، (B) ، (D) ، (F) و (ه) هي الصور 20X مدينة دبي للإنترنت. ردهة = ، فإنه = تدفق المسالك. الشكل 3. وفي 24 التسميد آخر ساعة ، uninjected اجنة لديها طويل ، مستقيم الجسم مع عدم وجود عيوب أو نخر خط الوسط (أ) و عينان محددة بوضوح مع الأنبوب العصبي بينهما (B). بعض الأجنة حقنوا مرنا حج ، في المقابل ، يحمل محور الجسم تقصير ، نخر ، somites شوه (C) ، وتصقلب (D). (أ) و (ج) هي صور مدينة دبي للإنترنت 4X ، (B) و (D) والصور 20X مدينة دبي للإنترنت.